[发明专利]编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法。编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸如SEQ ID NO.4所示。载体的构建方法包括提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA，合成二点委夜蛾触角cDNA；气味受体基因ORCO的克隆、回收、纯化；构建二点委夜蛾气味受体基因ORCO蛙卵表达载体pT7TS‑ORCO。本发明通过获取并分析一种编码农业害虫二点委夜蛾气味受体基因ORCO的基因序列，开发出一种可在非洲爪蟾卵母细胞中表达成蛋白质的载体构建方法，为后续鉴定该基因的确切生理功能提供可能，也为了解蛾类害虫嗅觉感受的作用机制及开发新型杀虫剂提供理论基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法。

背景技术

昆虫气味受体分为传统气味受体(traditional odorant receptor)和非典型的气味受体(atypical odorant receptor)。传统嗅觉受体包括普通的气味受体(odorantreceptor)和性信息素受体(pheromone receptor)，在不同昆虫间具有较低同源性，而非典型的气味受体ORCO主要在成虫触角中表达，且在不同种间序列和功能均高度保守。气味受体ORCO不与气味识别或结合，但对离子通道的形成意义重大，它与传统气味受体形成复合体ORX-ORCO，能极大促进气味分子与受体得特异结合。此前有研究显示，在昆虫中将ORCO基因沉默后，突变体对气味都不敏感，当转入OR基因拯救后又恢复正常，表明在昆虫气味识别过程中ORCO基因具有至关重要的作用。因此研究该基因的作用机制等有助于了解昆虫的生理功能，为开发新型杀虫剂提供理论基础。

基因功能的研究极大的依赖于载体及表达系统的构建，一个稳定性高的表达载体可高效表达目的基因，获得大量的蛋白质，为实验研究提供极大的便利。然后现有技术中缺乏稳定性高的气味受体基因ORCO的表达载体，导致表达载体转化入细胞后，阳性克隆细胞得率低。

发明内容

本发明提供的一种编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法，构建出了稳定的气味受体基因ORCO表达载体，阳性克隆细胞得率在90％以上。

本发明的第一个目的是提供一种编码昆虫气味受体的基因，编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供一种利用编码昆虫气味受体的基因构建蛙卵表达载体的方法，包括以下步骤：

S1，提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA，合成夜蛾触角cDNA；

S2，气味受体基因ORCO的克隆、回收、纯化

以二点委夜蛾cDNA为模板，以反向引物5’-TCAACTAGTGCCACCATGATGACCAAAGTGAAGACCCAG-3’，正向引物5’-TCACTCGAG TTACTTGAGTTGCACCAACACCAT-3’进行PCR扩增，对PCR产物进行回收、纯化；

S3，构建二点委夜蛾气味受体基因ORCO蛙卵表达载体pT7TS-ORCO

将pT7TS载体经BglⅡ和SpeⅠ双酶切，得到pT7TS酶切产物；将S2回收的PCR产物经BglⅡ和SpeⅠ双酶切，得到夜蛾酶切产物；将pT7TS酶切产物和夜蛾酶切产物连接，得到二点委夜蛾ORCO基因蛙卵表达载体pT7TS-ORCO。

优选的，上述的构建蛙卵表达载体的方法，S2中，PCR扩增体系如下：1μl夜蛾cDNA、2.5μl 10×Ex PCR Buffer、0.5mmol/L dNTP、GSPs 0.4μmol/L、UPM/NUPM 1μmol/L和2.5UTaq DNA聚合酶；