[发明专利]基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用

说明书

本发明提供了基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用。用于检测多肉植物茎腐病菌的LAMP引物组合由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明的检测体系在65℃等温条件下，通过1 h温育，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到多肉植物茎腐病菌，不需要复杂昂贵的仪器，能较好地满足对多肉植物茎腐病菌的现场检测，可广泛应用于基层单位田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治多肉植物茎腐病提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明属于园艺作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及多肉植物茎腐病菌的环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）检测的引物组合及其应用，可用于多肉植物茎腐病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于多肉植物茎腐病的早期诊断和监测鉴定。

背景技术

多肉植物是指植物营养器官肥大的高等植物，通常具根、茎、叶三种营养器官和花、果实、种子三种繁殖器官。在园艺上，又称肉质植物或多肉花卉，但以多肉植物这个名称最为常用。多肉植物作为盆栽在世界各地广受欢迎，目前常见的种类大多属于景天科和仙人掌科。

茎腐病的病原为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，是危害多肉植物的主要性真菌病害，属半知菌亚门真菌，也是一类世界性分布的真菌，分布极广，普遍存在于土壤及动植物有机体上，甚至存在于严寒的北极和干旱炎热的沙漠，属于兼寄生或腐生生物。它不仅可以在土壤中越冬和越夏，还会在不同的观赏植物上表现为不同的专化型；其专一性地引起观赏植物维管束病害，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡，影响产量和品质，该病是目前观赏花卉生产中防治比较困难的重要病害之一。多肉植物一遇此病会大量猝倒，萎缩死亡，植株茎部会开始出现褐色病斑，接着内部腐烂，直至全株猝倒死亡。由于多肉植物茎腐病是一种土传病害，防治上主要以预防为主，防治是否及时，直接影响了对土传病害的防治效果。因此生产上迫切需要建立一种快速、准确的检测多肉植物茎腐病菌的方法，为病害的早期诊断与防治、监测、预测预报提供支持和服务，对发展多肉植物生产、增加花农收入、减少环境污染和维持农业可持续发展，都具有重大的生产意义。

当前，病原菌的检测方法较多，传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能直观的在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为病原菌的分类鉴定提供了技术条件。如血清学免疫学技术、常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术为病原菌的分类鉴定提供了灵敏度高、快速的检测技术。但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依赖贵重、精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员，因而提高了检测成本，并限制了其应用范围，不利于基层生产上推广应用，限制了这些先进方法的推广应用。