[发明专利]引物去磷酸化引发的循环指数扩增检测碱性磷酸酶的方法

说明书

本发明公开了引物去磷酸化引发的循环指数扩增检测碱性磷酸酶的方法，采用传感器由DNA引物、发夹探针1和发夹探针2组成，发夹探针1和发夹探针2的5'端碱基均修饰荧光基团，与发夹探针1的5'端碱基互补的碱基修饰淬灭基团；与发夹探针2中的5'端碱基互补的碱基修饰淬灭基团，发夹探针1中的淬灭基团和3'端之间的碱基序列与DNA引物的碱基序列互补，发夹探针1的5'端和发夹探针1酶切识别序列之间碱基序列与发夹探针2中的淬灭基团与3'端之间的碱基序列互补，发夹探针2的5'端和发夹探针2酶切识别序列之间碱基序列与DNA引物的碱基序列互补。本发明的方法能够快速、超灵敏的检测碱性磷酸酶的活性。

技术领域

本发明属于生物分析技术，涉及引物去磷酸化引发的循环指数扩增检测碱性磷酸酶的方法。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛分布的水解酶，其催化各种磷酸化底物(例如蛋白质，碳水化合物和核酸)的去磷酸化，其在调控细胞周期，生长，凋亡、信号转导途径等多个细胞内过程中起着重要的作用。ALP的异常水平与骨疾病(例如佩吉特氏病，骨软化症和成骨细胞性骨癌)、肝脏疾病(例如梗阻性黄疸、肝炎和肝癌)、糖尿病、乳腺癌和前列腺癌等各种人类疾病密切相关。此外，由于其高催化活性，良好的稳定性和广泛的底物特异性，ALP是酶免疫测定、基因表达分析、组织化学染色和生物分子监测中使用最广泛的标记示踪剂之一。因此，开发一种有效可靠的ALP活性检测方法对于临床诊断和药物研发具有十分重要的意义。

目前为止，已经开发了多种方法来测量ALP的活性/水平，包括基于放射性标记的电泳法、色谱法、表面增强拉曼散射法、比色法、化学发光法和电化学测定法。尽管这些方法都具有各自的特色，但是它们会受到诸如有害辐射、灵敏度差、操作复杂、程序耗时、样品处理复杂、仪器昂贵以及需要蛋白质抗体固定在固体支持物上的限制。荧光方法具有快速分析、高灵敏、高通量、仪器简单、分析性能优等显著优点，所以将荧光方法与贵金属纳米团簇(如铜纳米粒子和银纳米团簇)、无机半导体(如碳量子点、硫化铜铟量子点、碳点和石墨量子点)、荧光聚合物(如聚乙烯亚胺聚合物，聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维和双氰胺化合物)和荧光剂(如Fmoc-K FITC FFYP)相结合，可用于ALP活性的测定。如利用铜离子(Cu²⁺)和焦磷酸(PPi)之间的强烈相互作用，PPi可以抑制双链DNA(dsDNA)为模板的铜纳米颗粒(CuNPs)荧光而实现对ALP的信号关闭荧光检测。而利用Cu²⁺介导的单链DNA(ssDNA)为模板的银纳米团簇的淬灭，也可实现对ALP的信号关闭荧光检测。基于PPi去磷酸化介导的PPi-Cu²⁺-PPi复合物拆分，实现对ALP的信号关闭荧光检测。利用PPi可以将硝基苯酯(PNPP)转化为PNP，从而来诱导碳点(CD)的淬灭，实现ALP的信号关闭荧光检测。而通过ALP诱导的含有一个磷酸基团的芘衍生物(Py-P，脂肪族磷酸酯)的荧光强度比(F378/F488)的增加，发展出用于ALP测定的荧光比率法。但是，以上所述荧光方法均涉及到荧光纳米材料的复杂合成和费时费力的实验操作，且由于信号关闭(signal-off)测定导致准确性差，由于缺乏信号放大导致灵敏度差。同时，在临床诊断中，由于成人体内ALP为40～190单位每升，含量较低，因而现有技术无法对低浓度ALP的活性进行高敏感检测。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种循环指数扩增检测碱性磷酸酶的传感器，采用该传感器能够快速、超灵敏的检测碱性磷酸酶的活性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种循环指数扩增检测碱性磷酸酶的传感器，由DNA引物、发夹探针1(HP1)和发夹探针2(HP2)组成；

DNA引物为单链DNA序列，DNA引物的3'端为磷酸化末端，发夹探针1和发夹探针2的均具有突出的3'端，发夹探针1和发夹探针2的5'端碱基均修饰荧光基团，与发夹探针1的5'端碱基互补的碱基修饰淬灭基团；