[发明专利]引物去磷酸化引发的循环指数扩增检测碱性磷酸酶的方法

权利要求书

1.一种循环指数扩增检测碱性磷酸酶的传感器，其特征是，由DNA引物、发夹探针1和发夹探针2组成；

DNA引物为单链DNA序列，DNA引物的3'端为磷酸化末端，发夹探针1和发夹探针2的均具有突出的3'端，发夹探针1和发夹探针2的5'端碱基均修饰荧光基团，与发夹探针1的5'端碱基互补的碱基修饰淬灭基团；

与发夹探针2中的5'端碱基互补的碱基修饰淬灭基团，发夹探针1中的淬灭基团和3'端之间的碱基序列与DNA引物的碱基序列互补，发夹探针1的5'端和发夹探针1酶切识别序列之间碱基序列与发夹探针2中的淬灭基团与3'端之间的碱基序列互补，发夹探针2的5'端和发夹探针2酶切识别序列之间碱基序列与DNA引物的碱基序列互补。

2.如权利要求1所述的传感器，其特征是，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。

3.如权利要求1所述的传感器，其特征是，DNA引物有19～21个碱基。

4.如权利要求1所述的传感器，其特征是，DNA引物从5'端至3'端的序列为T CGA TTGATG AAC ACT GCG A；

或，发夹探针1从5'端至3'端的序列为ACT ATA CAA CCT ACT ACC TTT CAG ACT CACGTA GTA GGT TGT ATA GTG TTT GTC ATC GCA GTG TTC ATC A；

或，发夹探针2从5'端至3'端的序列为TCG CAG TGT TCA TCA ATC GAC TTT CAG ACTCAC TCG ATT GAT GAA CAC TGC GAA TCT GAG AAC TAT ACA ACC TAC T。

5.如权利要求1所述的传感器，其特征是，包括DNA聚合酶和DNA切口酶。

6.一种循环指数扩增检测碱性磷酸酶的试剂盒，其特征是，包括权利要求1～5任一所述的传感器。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征是，包括10×ThermoPol缓冲液、10×NEBuffer3.1和dNTP溶液混合物。

8.一种权利要求1～5任一所述的传感器或权利要求6～7任一所述试剂盒在循环指数扩增检测碱性磷酸酶活性中的应用。

9.一种引物去磷酸化引发的循环指数扩增检测碱性磷酸酶的方法，其特征是，采用上述传感器或试剂盒，其过程为：

(1)待测液中的碱性磷酸酶催化DNA引物3'端的磷酸基团水解为羟基；

(2)水解后的DNA引物与发夹探针1的3'突出端杂交进行第一次链置换扩增反应获得第一个触发器并产生荧光信号；

(3)第一个触发器与发夹探针2的3'突出端杂交进行第二次链置换扩增反应获得第二个触发器并产生荧光信号；

(4)第二个触发器与发夹探针1的3'突出端进行杂交，以依次重复步骤(2)～(4)；

根据进行步骤(1)～(4)后产生的荧光信号获得待测液中的碱性磷酸酶的活性。

10.如权利要求9所述的方法，其特征是，用氯化镁和三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸的混合液将发夹探针1的DNA单链或发夹探针2的DNA单链稀释溶解，然后高温加热室温孵育即可；

或，步骤为：将DNA引物和碱性磷酸酶混合后在36～37.5℃下进行孵育一段时间后，加热以消除碱性磷酸酶的活性，获得A部分；将发夹探针1、发夹探针2、DNA聚合酶、DNA切口酶及dNTP溶液混合物进行混合后，获得B部分，将A部分和B部分混合后在55～60℃下孵育一段时间后，检测荧光强度即可；

优选的，DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶；

优选的，DNA切口酶为Nt.BstNBI；

优选的，B部分还有10×ThermoPol缓冲液和10×NEBuffer 3.1；

优选的，检测荧光时，激发波长为492nm。