[发明专利]一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用

说明书

本发明提供一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用，本发明的链霉菌基因组精简系统是在全基因组比对分析大片段冗余基因区的基础上，组合了同源重组系统和高效的位点特异性重组系统(Cre/loxP系统)进行靶向大片段缺失。同源重组系统中采用了基于自杀载体的同源重组策略，大大提高了敲除的靶向性和效率，用于一次性缺失约700Kb的冗余基因区时效率高达100％。本发明方法操作简单、高效、靶向性强、正确率高。本发明为构建链霉菌底盘细胞奠定了理论基础，有利于实现合成生物学底盘细胞的高效构建，为药物产业化和新药研发提供强大支撑。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种高效的链霉菌基因组精简系统构建及应用，尤其是一种基于同源重组系统与位点特异性重组系统相结合的大片段冗余基因敲除系统，

背景技术

链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，数十年来，链霉菌一直是新型抗生素研发的主要来源，众多链霉菌来源的次级代谢产物被用作药物先导化合物，开发出了临床上广泛使用的治疗性药物如免疫抑制剂、抗癌药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物及抗高血压药物等等。链霉菌作为许多重要抗生素的工业生产菌，具有合成多种多样复杂天然产物的能力，链霉菌基因组大小一般在6-10Mb之间，庞大的基因组中除了含有正常生长发育相关的必需基因以外，主要是各种类型的次级代谢生物合成基因簇基因。次级代谢生物合成基因簇一般是微生物在对抗外界不良环境的压力下进化出来的或者是通过水平基因转移获得的，所以一般认为在实验室培养条件下次级代谢生物合成基因簇相关基因为非必需基因。链霉菌基因组中含有大量的内源次级代谢生物合成基因簇，内源基因簇的表达一方面会与外源合成途径竞争前体和能量，另一方面会产生大量副产物，影响目标代谢产物的产量及下游分离纯化，通过消除副产物的产生可以实现目标产物的优质高产。

随着生物信息学分析技术和合成生物学使能技术的飞速发展，对链霉菌基因组进行深度分析可以发现其基因组中存在大量冗余基因，并且许多冗余基因集中分布在亚端粒区形成大片段的冗余基因区，冗余基因的表达将会消耗细胞大量的能量如DNA复制、转录、翻译能耗，严重降低了能量的有效利用率，同时会产生大量的副产物如非目标次级代谢产物、氨基酸、糖等等影响目标代谢产物的产量及下游分离纯化工程。因此，通过高效的基因编辑技术对冗余基因进行大规模的删减，既可以实现链霉菌基因组的精简，也可以降低内在能耗，使菌株代谢谱更加简单、清晰。基因组精简的链霉菌也可以作为底盘细胞实现外源天然产物或者药物的高效生物合成。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建方法，基于比较基因组学分析大片段冗余基因区，组合利用同源重组系统和高效的位点特异性重组系统实现大片段基因区的高效编辑，从而精简链霉菌基因组的方法。这是一种基于生物信息学分析数据，高效构建链霉菌底盘细胞的新技术。

本发明构建方法通过以下步骤实现：

(1)将测序的链霉菌的全基因组序列与NCBI中公知的天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor A3(2)(保藏号CGMCC 4.7168)全基因组序列(序列编号GenBank:NC_003888.3)和阿维链霉菌 Streptomyces avermitilis MA-4680(保藏号CGMCC 4.3588)全基因组序列(序列编号GenBank: NC_003155.5)共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；

(2)分析(1)中获得的全基因组比对数据，依据所有比对基因组中都保守存在的基因区为必需基因区，只在一种或两种基因组中存在的基因区为非必需基因区的理论，对链霉菌基因组进行区域划分为必需基因区和非必需基因区；

(3)选取(2)中划分出的一个非必需基因区中，生物合成基因簇比较集中的区域，为候选的大片段冗余基因区；