[发明专利]一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用

权利要求书

1.一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建，其特征在于，通过全基因组比对技术分析、定位链霉菌基因组中的大片段冗余基因区，构建链霉菌敲除质粒pKClox6、链霉菌自杀质粒pSETlox71及链霉菌表达质粒pNitCre，其中，敲除质粒pKClox66携带lox66位点，链霉菌温度敏感型复制子pSG5，Apra抗性；自杀质粒pSETlox71携带lox71位点，无链霉菌复制子，Spect抗性；表达质粒pNitCre携带链霉菌密码子优化的Cre重组酶，链霉菌游离型复制子pIJ101，Apra抗性。

2.根据权利要求1所述的一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)大片段冗余基因区的确定通过以下步骤实现：

1)将测序的链霉菌的全基因组序列与NCBI中公布的天蓝色链霉菌全基因组序列和阿维链霉菌全基因组序列共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；

2)分析全基因组比对结果，依据所有比对基因组中都保守存在的基因区为必需基因区，只在一种或两种基因组中存在的基因区为非必需基因区的理论，对链霉菌基因组进行区域划分为必需基因区和非必需基因区；

3)选取一个非必需基因区中，生物合成基因簇比较集中的区域，为候选的大片段冗余基因区；

(2)链霉菌敲除质粒pKClox66的构建通过以下步骤实现：

1)以pHAH质粒为模板，设计特异性引物扩增lox66片段，并在其两端引入XbaI和EcoRV酶切位点，酶切纯化后，备用；pKC1139质粒用XbaI和EcoRV双酶切后回收；

2)步骤1)中酶切处理的lox66片段连入酶切处理的pKC1139载体，获得链霉菌敲除质粒pKClox66；

(3)链霉菌自杀质粒pSETlox71的构建通过以下步骤实现：

1)pSET152载体用HindIII单酶切，回收较大的DNA片段；

2)步骤1)中回收的DNA片段，加入T4DNA连接酶自连环化后获得pSET153质粒；

3)步骤2)中获得的pSET153质粒用SacI单酶切，回收较大的DNA片段，备用；

4)以pIJ779为模板，设计特异引物扩增壮观基因片段，并在其两端引入SacI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；

5)步骤4)中纯化的DNA片段连入步骤3)中回收的DNA片段，获得pSET154质粒；

6)以pHAH为模板，设计特异引物扩增lox71片段，并在其两端引入HindIII和XbaI酶切位点，酶切纯化后，备用；pSET154质粒用HindIII和XbaI双酶切后回收，备用；

7)步骤6)中酶切处理的lox71片段连入酶切处理的pSET154载体，获得链霉菌自杀质粒pSETlox71；

(4)链霉菌表达质粒pNitCre的构建通过以下步骤实现：

1)以pALCre为模板，设计特异引物扩增Cre基因片段，并在其两端引入NdeI和HindIII酶切位点，酶切纯化后，备用；

2)pIJ8668-nit-pIJ101ori-MCS质粒用NdeI和HindIII双酶切，回收较大的DNA片段，备用；

3)步骤1)中回收的DNA片段与步骤2)中回收的DNA片段连接，获得链霉菌表达质粒pNitCre。