[发明专利]核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向

权利要求书

1.一种通过在小鼠胚胎干(ES)细胞中进行同源重组以修饰基因组的靶基因座的方法，所述方法包括：

(a)向所述小鼠ES细胞中引入：

(i)锌指核酸酶(ZFN)，所述锌指核酸酶在基因组的靶基因座或其附近产生单链或双链断裂，和

(ii)大靶向载体(LTVEC)，所述大靶向载体包含翼侧为上游同源臂和下游同源臂的插入核酸；其中所述插入核酸的长度范围为5kb至30kb，并且所述上游同源臂和所述下游同源臂的总和是至少10kb；

(b)检测所述小鼠ES细胞中所述插入核酸整合进入所述基因组的靶基因座的情况，其中所述整合使得在所述靶基因组的基因座处内源性核酸序列缺失并被所述插入核酸取代；以及

(c)选择经靶向的小鼠ES细胞，所述小鼠ES细胞包含在所述基因组的靶基因座中的所述插入核酸，其中与单独使用LTVEC相比，将所述LTVEC与所述ZFN联合使用使得靶向效率增加。

2.根据权利要求1所述的方法，其中与单独使用LTVEC相比，所述LTVEC的靶向效率增加至少2倍。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述ZFN是表达构建体，所述表达构建体包含编码ZFN蛋白的核酸序列，并且其中所述核酸与在小鼠细胞中有活性的启动子可操作地连接。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述ZFN是编码ZFN蛋白的mRNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述ZFN的靶序列位于所述基因组的靶基因座的内含子、外显子、启动子或增强子区中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含选择性表达盒。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含报告基因。

8.根据权利要求1所述的方法，其中将所述插入核酸整合进入所述基因组的靶基因座使得在所述基因组的靶基因座缺失内源性基因。

9.根据权利要求1所述的方法，其中将所述插入核酸整合进入所述基因组的靶基因座导致敲除、敲入、点突变、结构域交换、外显子交换、内含子交换、调节序列交换、基因交换或其组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含人源核酸序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中检测步骤(b)通过等位基因修饰(MOA)检测实施。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含与在所述基因组的靶基因座处的被取代的核酸序列具有同源性的核酸序列。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含与在所述基因组的靶基因座处的被取代的核酸序列具有直系同源性的核酸序列。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入核酸包含来自非小鼠的种属的核酸序列。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述LTVEC的长度范围为50kb至300kb。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述LTVEC的长度范围为50kb至100kb。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述LTVEC的长度范围为100kb至200kb。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述LTVEC的长度范围为200kb至300kb。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述上游同源臂和所述下游同源臂的总和的范围为10kb至100kb。