[发明专利]一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域，更具体地，涉及一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用。该方法首先通过对蛋白A的抗原表位分析，把可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重组蛋白片段，用此片段免疫动物得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备中采用大肠杆菌表达系统，能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备特异性识别蛋白A的多克隆抗体。本发明制备的特异性识别蛋白A的多克隆抗体可应用于定量检测试验样品中Protein A的残留水平，同时也便于Protein A纯化介质制造商监测特定条件下Protein A的脱落特征。

技术领域

本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域，更具体地，涉及一种特异性识 别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白A是葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)的简称，是一种 从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁中分离的蛋白质。蛋白A主要 有5个结合抗体的功能域，每个结构域大约由58个氨基酸残基组成(1、Karen L.A，Julia D.B，EmilyS.S.aureus IgG-bindingproteins SpA and Sbi：Host specificity andmechanisms ofimmune complex formation，MolecularImmunology，2008，45： 1600-1611；2、逢少蕉，梁浩，宋淑亮，葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用， 生命的化学，2008，28卷第6期，748-751)。

在单克隆抗体药物的纯化过程中，以蛋白A为基础的亲合层析是广泛应用 的纯化方法之一，该方法中Protein A是通过共价偶联方式结合于纯化介质之上， 单克隆抗体可以有效的在此步骤中得到纯化。然而，在蛋白A亲合层析柱使用 过程中会有微量的蛋白A从层析柱上脱落下来。研究表明蛋白A可能对人体有 潜在的危害，它的生物学作用包括刺激人体多种细胞素(IFNγ，TNFα，IL-1 α，IL-1β，IL-2，IL-4)的释放。此外如果抗体产品污染有Protein A也可能影 响免疫检测的结果。因此用精确灵敏的方法来确证单克隆抗体药物中蛋白A的 残留处于一个较低的和稳定的水平是单克隆抗体药物的质量标准之一。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种特异性识别蛋白A的 多克隆抗体及其制备方法和应用，通过对蛋白A的抗原表位分析获得可产生较 强免疫原性位点的基因片段，并进行PCR扩增、构建表达载体、免疫动物得到 特异性针对该位点的抗体。该抗体可应用于定量检测试验样品中Protein A的残 留水平。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提出一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备 方法，包括如下步骤：

(1)蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白A 的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

(2)将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体构建含有 如SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大 肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白A抗原；

(3)将所述重组蛋白A抗原免疫动物，经血清分离纯化获得特异性识别蛋 白A的多克隆抗体。

进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SE Q ID No.3所示。

进一步地，所述步骤(2)中的表达载体为PET28a。

进一步地，所述大肠杆菌感受态为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。