[发明专利]一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201811000557.X | 申请日： | 2018-08-30 |
| 公开（公告）号： | CN109182364A | 公开（公告）日： | 2019-01-11 |
| 发明（设计）人： | 吴刚;谢胜平;易红波 | 申请（专利权）人： | 武汉百意欣生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C07K16/12;G01N33/68 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 蛋白A 多克隆抗体 位点 制备 制备方法和应用 特异性识别 种特异性 重组蛋白 大肠杆菌表达系统 抗原表位分析 制备重组蛋白 氨基酸序列 介质制造商 强免疫原性 定量检测 基因片段 检测试剂 免疫动物 生物科学 试验样品 抗体 扩增 引物 残留 监测 应用 保证 | ||
1.一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白A的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；
(2)将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体构建含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白A抗原；
(3)将所述重组蛋白A抗原免疫动物，经血清分离纯化获得特异性识别蛋白A的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的表达载体为PET28a。
4.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)得到的重组蛋白A抗原的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中重组蛋白A抗原免疫的动物为母鸡。
7.根据权利要求6所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫母鸡的具体方法为：取纯化后的重组蛋白A抗原免疫待产母鸡，连续免疫四次，间隔15-30天免疫一次，首免剂量500-600μg/只，以后每次免疫300-400μg/只，免疫四次之后第8天开始收集鸡蛋，即为含重组特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋。
8.根据权利要求7所述的一种特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，含特异性识别蛋白A的多克隆抗体的鸡蛋进行分离纯化的具体步骤为：取鸡蛋放入75％酒精中浸泡5分钟，将其蛋壳敲碎取出蛋黄放在滤纸上吸附掉残留蛋清，破除蛋黄上的细胞膜，然后按1：9用去离子水稀释混匀，然后加入1％辛酸，在搅拌机上搅拌30min，调节pH至5.1，置4℃冰箱6h；取出8000g离心5min，上清用滤纸过滤；加入固体硫酸铵至终浓度为50％，4℃静置1h，5 000g离心20min,弃上清；再用和卵黄加水之后相同体积的PBS溶解后，采用截留50KD分子量的膜包进行超滤，获高纯度的重组特异性识别蛋白A的多克隆抗体。
9.一种权利要求1-8任一项所述特异性识别蛋白A的多克隆抗体的制备方法在试验样品中蛋白A的定量检测中的应用。
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