[发明专利]一种鉴别新疆额尔齐斯河北方须鳅隐存种的分子生物学方法

说明书

本发明公开了一种鉴别新疆额尔齐斯河北方须鳅隐存种的分子生物学方法，包括如下步骤：1)采用酚‑氯仿法分别提取北方须鳅组织的基因组DNA；2)设计线粒体COI基因的引物；3)以两种鱼的DNA为模板，进行PCR扩增；4)PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选条带清晰的PCR产物进行测序；5)采用Mega6.0软件计算得到北方须鳅与其隐存种之间的K2P遗传距离，基于K2P遗传距离构建邻接系统关系树，且对获得的序列进行比对。有益效果为：本发明分子生物学方法科学有效、简单快捷、准确可行，特异性强、可信度高，不用处死北方须鳅，能够一次性对物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别新疆额尔齐斯河北方须鳅隐存种的分子生物学方法。

技术背景

北方须鳅Barbatula barbatula nuda隶属于鲤形目、鳅科、条鳅亚科、鳅属，是栖息于溪流中的小型底栖杂食性鱼类。分布于俄罗斯鄂毕河流域、蒙古、朝鲜半岛和北海道等地，我国新疆北部的额尔齐斯河、河北北部、内蒙古东部、黑龙江、滦河上游等北方地区均有分布。根据新版《新疆鱼类志》记载，我国新疆地区目前有3种须鳅属鱼类，分别为小眼须鳅Barbatula microphthalma、穗唇须鳅Barbatula labiata和北方须鳅Barbatulabarbatula nuda，且前两者皮肤光滑、无鳞片。北方须鳅的分类地位一直以来存在较多争议，有学者把广泛分布于中国北方的北方须鳅Barbatula barbatula nuda有效名称作Barbatula toni，也有认为是阿勒泰须鳅Barbatula altayensis。北方须鳅主要特征是唇面光滑或有浅皱褶，上唇边缘的中间有一个较深的四痕，下唇近口角处唇叶向后伸展。第一鳃弓鳃耙一般有8-11枚。鱼鳔退化残留一小膜质室。体表覆盖细鳞，一般前躯稀少、胸部无鳞，但在对新疆额尔齐斯河采集的一尾北方须鳅样本进行形态学鉴定时发现该个体胸部披有细鳞。由于二者形态非常相似，差别十分细微，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分北方须鳅隐存种的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit I，COI)为线粒体基因组的蛋白质编码基因，由于进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。大量的研究结果表明，运用COI基因可以对超过95％的物种进行准确鉴定，当物种间K2P遗传距离不超过2％的临界值时，可被判定为相同物种。因此，COI基因也被广泛作为物种鉴定的DNA条形(DNA barcoding)，其变异为不同动物门类中关系密切的物种类群提供一种快速、准确和自动化的识别方法，从而构建物种鉴别体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、易于掌握、准确性高，不用处死北方须鳅，能够一次性对物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点，能够解决须鳅属鱼类种质混杂问题的鉴别新疆额尔齐斯河北方须鳅隐存种的分子生物学方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种鉴别新疆额尔齐斯河北方须鳅隐存种的分子生物学方法，其特征在于：包括如下步骤：

采用酚-氯仿法分别提取北方须鳅组织的基因组DNA；

设计线粒体COI基因的引物；

以两种鱼的DNA为模板，进行PCR扩增；

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选条带清晰的PCR产物进行测序；

采用Mega6.0软件计算得到北方须鳅与其隐存种之间的K2P遗传距离，基于K2P遗传距离构建邻接(Neighbor-Joining，NJ)系统关系树，且对获得的序列进行比对。