[发明专利]基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的引物及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的引物和试剂盒及方法。试剂盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物组合、无RNA酶的超纯水、病毒总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，配置LAMP反应体系，进行微滴化和LAMP反应后，通过检测荧光信号，判断待检样品是否含有猪圆环病毒2型，并测定其含量。本发明具有快速、精准、灵敏、适用性广，无需依赖变温扩增设备，可实现绝对定量等优点，可实现猪圆环病毒2型病毒诊断的早发现、早治疗和早预防，能有效控制疫情爆发。

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型测试装备，具体涉及一种基于数字LAMP技术检测猪圆环病毒2型的试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)是目前已知的最小的动物病毒，不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合征的病原，而且如猪皮炎肾病综合症、猪繁殖与呼吸综合征、仔猪先天震颤、增生性坏死性肺炎等疾病也与PCV-2有关。此外，它能导致猪生长缓慢，饲料报酬降低，同时导致免疫机能下降，诱发其他疾病混合感染，给养殖户造成巨大的经济损失，也严重制约着养猪业的快速发展。目前，PCV-2已经成为严重阻碍我国养猪业发展的主要病原之一。为此，建立早期快速检测方法对猪圆环病毒2型的预防和控制具有十分重要的意义。

目前，国内外对PCV-2检测方法进行了大量的研究，已经建立了多种PCV-2检测方法，实验室常用的检测猪圆环病毒2型的方法有病毒分离培养、免疫学技术(免疫荧光技术，酶联免疫吸附试验，免疫胶体金技术、免疫过氧化物酶单层细胞试验)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的病毒分离和免疫学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。总体而言，目前各种方法都有其局限性，检测体系尚不够完善。

数字环介导等温扩增技术(digital loop-mediated isothermalamplification,dLAMP)是基于第三代数字PCR技术原理，将预混的LAMP体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过LAMP扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。该方法具有以下优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其他非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。

为了解决上述传统方法检测猪圆环病毒2型面临的问题，迫切需要开发一种快速、高效、低成本的检测技术，并实现检测试剂商品化，这将对PCV-2的防控带来极大便利。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种数字LAMP技术检测PCV-2型的试剂盒，能够应用于PCV-2的快速、精准检测。

本发明的第一个技术目的是提供用于检测PCV-2的特异性引物，其核苷酸序列分别：

外引物F3：AAGGCAACTTACTGATAGAATGT(SEQ ID NO：1)；

外引物B3：TCCTCCGTGGATTGTTCT(SEQ ID NO：2)；

内引物FIP：GCAACGGTCACCAGACTCCACAACGGAGTGACCTCT(SEQ ID NO：3)；