[发明专利]一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法

说明书

本发明公开了高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，所述方法包括种子活化、接种种子罐、移种发酵罐培养、流加补料培养、诱导表达以及离心收菌、破碎澄清的步骤，该方案可有效提升重组大肠杆菌在高密度培养条件下可溶性重组蛋白的表达量，较普通的培养方案在提升菌体密度的同时，明显提升可溶性蛋白的表达量，且具有无需调控pH，操作方便，可控性强，稳定性好、生产成本低以及可规模放大的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法。

背景技术

大肠杆菌高密度发酵诱导表达外源基因，因其使用的载体和表达的蛋白的不同，方法差异较大。目前主要是通过改变载体，添加增溶标签(苏鹏，龚国利.优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展.生物技术通报，2017)，来增加蛋白可溶性表达，但是这种方法并不适用于生产，药用重组蛋白制品，通常是不可以添加标签的，这就大幅度降低了增溶标签的应用价值。另一个优化方向，是在发酵领域，通过不同的发酵策略，来提升外源蛋白的可溶性表达(宋浩，重组大肠杆菌表达外源蛋白的共性发酵调控策略研究.华东理工大学，2016)，但是不同的载体，不同的细胞，发酵条件各异，还有其他相关的专利技术文献，例如：

CN201310517277.7一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，

CN201410541799.5一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法，

CN201310534045.2一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法。

因此需要开发新技术，来调整外源蛋白表达量，尤其是满足工业化应用的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种简单有效、可防止包涵体产物形成的方法，能够提高重组轮状病毒P2-ΔVP8*抗原(*代表非天然蛋白)可溶性表达的高密度培养方案，具有操作简便、生产成本低以及可规模放大的特点。

本发明所述的一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其包括如下步骤：

(1)种子活化：将重组蛋白大肠杆菌工程菌接入培养基中活化；

(2)接种种子罐：再将步骤(1)所得活化后的菌液接种种子罐培养至OD₆₀₀≥4；

(3)移种发酵罐培养：将种子罐中所有菌液转移至50L发酵罐，温度37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD₆₀₀≥4；培养期间，pH会略有上升，不会超过7.5，无需调控；

(4)流加补料培养：按照3.5mL/min的速度起始，每小时递增3.5mL/min的速度，缓慢流加25％的葡萄糖，继续维持上述条件培养；此时补充的葡萄糖作为碳源，维持菌体生长，pH会逐渐降低，但不会低于6.8，无需调控。

(5)诱导表达：培养至OD₆₀₀≥30，停止补葡萄糖，30min后，流加诱导培养基，按照10mL/min的速度起始，约30min后降温至18℃，添加0.5mM IPTG，每3h递增7mL/min的速度持续流加诱导培养基；诱导12h，停止培养；诱导表达期间，降低温度、添加迟效氮源培养基、使用较低浓度IPTG，目的都是控制蛋白表达处于较低速度，有利于蛋白质正确折叠，提升可溶性表达。整个诱导表达期间补充了一定的氮源成分(诱导期间流加的大豆蛋白胨和酵母提取物)，pH会逐渐上升，但是不会高于8，无需调控。

(6)离心收菌、破碎澄清，收集澄清后的液体即为重组轮状病毒ΔVP8*抗原的蛋白原液。