[发明专利]一种发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对及其应用

说明书

本发明涉及一种发酵乳制品中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)实时荧光定量PCR引物对及其应用，所述发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。应用该引物对，结合实时荧光定量PCR技术可以实现对发酵乳制品中嗜热链球菌快速、有效的定性、定量检测，与益生菌的传统检测方法相比，省时省力，稳定性好，可以用于大量样品的检测，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种发酵乳制品中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)实时荧光定量PCR引物对及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，革兰氏阳性，是益生菌的一种，具有调节人体胃肠道菌群平衡、抗突变、增强免疫力等能力，广泛用于生产一些重要的发酵乳制品，包括酸奶和活菌乳酸饮料等。目前，市场上发酵乳制品种类繁多，国标中对发酵乳制品中嗜热链球菌的活菌数量有着严格的规定和要求，但在其活菌数量的检测方面缺乏科学、快速、有效的方法。

目前益生菌的检测主要通过传统的检测技术，如平板计数法、显微镜直接计数法、生理生化鉴定，其缺点是费时又费力，检测易受培养条件和菌种特性的影响，稳定性差，难以用于大量样品的检测。因而，建立发酵乳制品中嗜热链球菌的快速定性、定量评估方法是很有必要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对。

另一方面，本发明还提供了应用该引物对对发酵乳制品中嗜热链球菌的快速检测方法，以及该引物对在嗜热链球菌定性、定量试剂盒中的应用。

本发明技术方案如下：

一种发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，上述引物对是根据嗜热链球菌16S RNA的保守序列片段进行设计和筛选，该引物对的扩增片段长度为190bp。

根据本发明，发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对的应用，用于发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR检测。

一种发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR检测方法，步骤如下：

(1)提取发酵乳制品中的总RNA，将提取的总RNA进行反转录，得cDNA，-20℃保存；

(2)以步骤(1)中的cDNA为模板，利用上述嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对，进行实时荧光定量PCR；

(3)通过Ct值对发酵乳制品中嗜热链球菌进行定性判定，若Ct值≤35，则为阳性，认为发酵乳制品中含有嗜热链球菌，否则，为阴性，认为发酵乳制品中不含嗜热链球菌；并通过标准曲线对发酵乳制品中嗜热链球菌进行定量检测。

根据本发明优选的，上述步骤(2)中，所述总RNA采用Trizol法提取。

根据本发明优选的，上述步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR的反应体系：1.0μLcDNA模板、0.5μL浓度为10μM的上游引物、0.5μL浓度为10μM的下游引物、10μL 2×SYBRpremix Ex taq^TM、8μL ddH2O，总计20μL。

根据本发明优选的，上述步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR的反应体系：95℃预变性10min；95℃变性10s，58℃退火45s，共45个循环。

一种嗜热链球菌定性、定量检测试剂盒，包括上述发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量PCR引物对。