[发明专利]食用肉类鉴别阳性对照品及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种食用肉类鉴别阳性对照品及其制备办法和应用，属于PCR鉴别技术领域。该对照品的制备方法包括以下步骤：S1扩增：取经确证的牛、羊、猪、鸡、鸭和驴肉中的至少一种，分别用对应的引物对进行PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，分别回收特异性DNA条带；S2纯化：上述特异性DNA条带以吸附柱进行纯化；S3连接：纯化DNA产物与载体进行连接；S4转化：连接产物分别转化至大肠杆菌感受态细胞，获得转化细菌；S5培养：转化细菌涂板培养后进行阳性克隆菌落的筛选，挑取阳性菌落进行扩增，即得阳性对照品。上述食用肉类鉴别阳性对照品与常规肉类鉴别时采用的经鉴定阳性对照品相比，具有DNA信息明确、稳定、便于保存的优点，可作为标准物质使用。

技术领域

本发明涉及DNA鉴别技术领域，特别是涉及一种食用肉类鉴别阳性对照品及其制备方法和应用。

背景技术

自1987年英国首先发生疯牛病以来，世界各国和地区都先后颁布了法律和法规以控制动物源性成分的使用。2013年初，一些欧洲国家卷入“马肉风波”丑闻后，引起各国对肉及肉制品掺假问题的关注。

目前国内市场上存在较为严重的肉类掺假现象，其中牛羊肉的掺假情况最为突出。常见的是用猪肉掺假牛肉和羊肉，用鸭肉和牛肉掺假羊肉等。巨大的价格差异，是不法商贩掺杂掺假的经济动因。伴随肉类食品掺假的手段和花样不断地翻新所产生的商业欺诈、市场乱象、贸易纠纷等问题同样不容忽视。普通消费者难以通过感官分辨掺假肉，即使是执法部门在取证过程中目前也缺乏简便有效的技术手段，对掺假肉打击乏力是肉类掺假愈演愈烈的技术原因。基于食品安全性与质量监督的需要，有必要对常见食用肉成分进行检测。

传统方法对常见食用肉成分种源的鉴定主要依赖于感官和形态学检验。感官检验准确度低，局限性大，对加工过的掺假样品基本无法鉴别。所以，一套科学、快速、准确、高通量的筛选方法将会为检测和执法人员提供强大的技术支撑。

目前国内外在肉类食品检测上普遍采用化学分析方法、紫外光谱分析等方法，上述方法在肉类食品检验中存在着特异性不强、操作繁琐、费用高等弊端，难以满足对肉类食品鉴定的要求。其他被广泛报道的检测手段还有红外光谱技术、色谱技术、酶联免疫分析技术及DNA检测技术等。

近红外光谱检测技术是在近红外光波长范围内对肉类中的蛋白质、核酸、脂肪等化合物中大量的含氢基团进行检测，主要应用于肉类成分鉴别、品质鉴别以及真伪鉴别。国外已经有相关报道。Ding等利用近红外光谱分别检测了袋鼠肉和牛肉，并建立了多元性回归模型区分袋鼠肉和牛肉。Morsy等利用近红外光谱对新鲜和解冻的牛肉进行了定量检测，发现其检测相关系数和标准偏差均有差异。近红外光谱检测技术具有快速、制样简单、同时测定多组分和无污染的特性，但因成本比较高，需建立分析模型，在线检测精度不高等，有待进一步研究。

色谱分析主要是对肉类氨基酸、蛋白质、肽类等成分的分析而鉴定其种类。Giaretta等利用阳离子交换色谱检测猪肉和牛肉的肌红蛋白，通过色谱谱图上的差异区分猪肉和牛肉的分离组分，以色谱峰面积变化识别牛肉中掺入猪肉成分含量。色谱分析检测限低，定量更准确，应用范围更广泛，但成本较高。利用色谱技术进行肉类鉴别起步较晚，但近年来随着高分辨色谱仪器的出现，利用色谱技术鉴定物种已经成为新的热点。

早在1980年代，就有学者将酶联免疫分析方法应用于肉类鉴别测试当中。Kangethe等利用酶联免疫反应鉴别马肉和牛肉。Rencova等利用ELISA方法鉴别了家禽、马、袋鼠等肉类。目前国外的一些公司已经研发出利用利用酶联免疫分析检测肉类的仪器，但肉类加工过程中，蛋白质易变性而使酶联免疫反应失效，所以ELISA方法只适合于未加工过的肉制品，应用范围相对较窄。