[发明专利]食用肉类鉴别阳性对照品及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法，其特征在于，包括以下步骤：

S1扩增：取经确证的牛、羊、猪、鸡、鸭和驴肉中的至少一种，分别用下述对应的引物对进行PCR扩增；

牛：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-GAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3'

羊：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-TATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA-3'

猪：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3'

鸡：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-GATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'

鸭：上游引物：5'-GGCTTCTACTACGGCTCCTA-3'

下游引物：5'-TCTGGTTTGATGTGTGGTGG-3'

驴：上游引物：5'-TCGAATGAATCTGAGGTGGA-3'

下游引物：5'-ACATGTGTAGGGTAGGGATG-3'

取上述PCR产物，以琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，分别回收牛、羊、猪、鸡、鸭和驴肉的特异性DNA条带；

S2纯化：取上述获得的特异性DNA条带，以吸附柱进行纯化，分别得牛、羊、猪、鸡、鸭和驴肉的纯化DNA产物；

S3连接：取上述获得得纯化DNA产物与载体进行连接；

S4转化：将上述连接产物分别转化至大肠杆菌感受态细胞，获得转化细菌；

S5培养：将上述转化细菌涂板培养后进行阳性克隆菌落的筛选，挑取阳性菌落进行扩增，提取质粒，电泳鉴定得到特异性条带，即得阳性对照品。

2.根据权利要求1所述的食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法，其特征在于，所述S1扩增步骤中，牛的特异性DNA条带为254±10bp的条带，羊的特异性DNA条带为317±10bp的条带，猪的特异性DNA条带为379±10bp的条带，鸡的特异性DNA条带为207±10bp的条带，鸭的特异性DNA条带为512±10bp的条带，驴的特异性DNA条带为447±10bp的条带。

3.根据权利要求1所述的食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法，其特征在于，所述S2纯化的具体步骤为：

溶解胶块：将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，加入PN溶液溶解胶块，得胶块溶液；

过柱：将胶块溶液上样至吸附柱CA2中，以PW液进行漂洗，晾干；向吸附柱CA2的吸附膜滴加ddH₂O，收集洗脱的DNA液体；或向吸附柱CA2的吸附膜滴加洗脱缓冲液EB，收集洗脱的DNA液体。

4.根据权利要求1所述的食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法，其特征在于，所述S3连接步骤中，所述载体为pGM-T载体，且所述DNA产物与载体的摩尔比为3-5:1。

5.根据权利要求1所述的食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法，其特征在于，所述S4转化的具体步骤为：将连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中混匀，冰浴后热休克，再放置于冰上冷休克；再加入SOC培养基，恒温培养，得转化细菌液。

6.根据权利要求5所述的食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法，其特征在于，所述S5培养的具体步骤为：将x-gal和IPTG混匀后点状滴于LB培养基上，均匀涂抹，避光室温放置；将上述转化细菌液离心后弃去上清液，将剩余转化细菌液混匀后滴加于LB固体培养基上，均匀涂开，恒温培养；挑取白色阳性菌落进行扩增，将该白色阳性菌落加入LB液体培养基中，并加入Amp后恒温振荡培养，得扩增菌落，即为阳性对照品。

7.权利要求1-6任一项所述的食用肉类鉴别阳性对照品的制备办法制备得到的阳性对照品。