[发明专利]一种基于灰霉毒素倍半萜合酶BcBOT2基因的植物灰霉病分子检测方法

说明书

本发明公开了一种基于灰霉毒素倍半萜烯合酶BcBOT2基因的植物灰霉病致病病原—灰葡萄孢霉的特异性引物及其早期分子检测方法。本发明针对灰葡萄孢霉毒素——二环倍半萜烯毒素合成途径中关键酶倍半萜合酶BcBOT2基因序列，设计出一套特异性引物对，该引物对由2条特异性引物BCbot2‑F2和BCbot2‑R2组成，并建立了倍半萜合酶BcBOT2基因的检测方法，检测结果可以判定待检测样品中是否存在灰葡萄孢霉基因。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率好、检测时间短，操作简单，特异性高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测植物灰霉病病原灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）致病毒素的检测引物及其分子检测方法。

背景技术

由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的植物灰霉病是一种世界性、侵染性致病菌，可引起番茄、黄瓜、草莓、梨、洋葱、蒜薹等200多种园艺植物灰霉病，也是贮藏期重要病害。研究发现灰葡萄孢常在植物发育早期阶段侵入宿主，并在相当长时间内保持沉默，直到宿主植物生理发生变化有利于其生长时，快速引发宿主软腐，造成植物组织的严重破坏。究其原因是由于植物病原真菌在与宿主植物相互识别、相互作用的过程中会产生次生代谢产物——真菌毒素，其在致病过程中会起决定因子的作用。因此对于植物灰霉病病原——灰葡萄孢霉产毒真菌毒素特异性基因序列的检测，对该病害的早期诊断与防控有着重要的意义。

1963年，Aksenova发现从灰葡萄孢分离一类多糖类物质可引起卷心菜叶斑症状，从而发现该病原菌中具有某种致病因子。随后，开展了一系列灰葡萄孢致病因子提取纯化，及其生物学特性等方面的研究。1974年二环倍半萜烯Botrydial毒素最早被分离鉴定出来，在所有已经分离鉴定出的20余种灰葡萄孢毒素物质中，Botrydial的毒性最高，其余多为其前体或衍生物。经活体实验结果表明，灰葡萄孢分泌Botrydial越多，其对宿主细胞表现出的毒力就越高。

经研究发现Botrydial毒素是萜类化合物，这些化合物帮助植物真菌突破宿主的细胞防御。研究发现Botrydial毒素在被灰葡萄孢霉侵染的辣椒、菜豆、拟南芥和蓝莓等植株上都有存在，可以造成不同植物组织为害，正是因为这样灰霉病菌才能引发大面积的植物病害。Isidro等人发现，被灰葡萄孢侵染的宿主植物出现伤口后，植物组织细胞中就可以检测到Botrydial毒素，但植物本身并不能分泌这种化合物。随着植物叶片上萎黄程度增高，检测到 Botrydial的量也增加，所以灰葡萄孢分泌的二环倍半萜类毒素被认为是灰霉病致病的关键因素，这些毒素可以引发宿主植物萎黄病和组织细胞破裂。研究表明，Botrydial毒素基因的生物合成基因转录、翻译调控是导致病原菌致病力差异的主要原因。而不同菌株间的致病力差异，不同寄主的抗病性的差异也主要与毒素基因的转录调控相关。Botrydial毒素的发现为灰霉病的防治提供了新思路，目前已有研究报道部分Botrydial生物合成前体物质不具对寄主的致病性，发现Botrydial毒素合成途径中关键酶—倍半萜合酶的的正常翻译表达，可显著影响灰葡萄孢霉对植物组织的致病。如采取措施减缓或切断Botrydial的生物合成途径可以显著降低灰葡萄孢的致病力。同时，编码Botrydial毒素的基因组序列的测序成功，也为寄主组织毒素因子PCR检测技术的建立奠定基础，可用来早期诊断寄主植物是否存在潜在的致病菌株。植物灰霉病由于其侵染的潜伏性等原因，造成其对早期检测与诊断的要求较高。因此，本技术通过利用毒素基因检测为其早期诊断提供一种有效途径。

基于灰霉毒素倍半萜合酶BcBOT2基因的PCR扩增技术，具有检测时间短，灵敏度和特异性高，操作简单等优点。目前，PCR检测方法已经成功应用于多种植物病原微生物的检测，如番茄黄化曲叶病毒、柑橘溃疡菌、镰刀菌、小麦叶锈病菌等，在病害发病初期即可快速的对病害进行诊断，及时指导农民采取有效的防治措施。而对基于灰霉毒素倍半萜合酶BcBOT2基因的检测目前还没有报道。