[发明专利]一种PSR检测耐甲氧西林金葡菌的引物、试剂盒与方法

权利要求书

1.一种PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物，其特征在于，包含femA的检测引物及mecA的检测引物，所述的检测引物的核苷酸序列如下所示：

靶点femA检测引物Ft:

5’-AGGTATAGACTTCGATGTTTCAAATCGCGGTCCAGTG-3；

靶点femA检测引物Bt：

5’-TTGTAGCTTCAGATATGGAAACCAATCATTACCAGCA-3’；

靶点mecA检测引物Ft：

5’-CCAATAACTGCATCATCTGCGACTTCACATCTATTAGG-3’；

靶点mecA检测引物Bt：

5’-TCTACTACGTCAATAACCGACACGATAGCCATCTTCA-3’。

2.一种PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：

包括权利要求1所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物。

3.根据权利要求2所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：

所述的引物的浓度为50 μM。

4.根据权利要求2所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40 mM的Tris-HCl，20 mM的硫酸铵，20 mM的氯化钾，16 mM的硫酸镁，0.2%（v/v）的Tween 20，1.4 M的甜菜碱，10 mM的 dNTPs；

B、Bst DNA 聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：

组分B中所述的Bst DNA 聚合酶的浓度为8 U/μL；

组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液中钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:（4～8）。

6.根据权利要求4所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：

组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液中钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1: 4。

7.根据权利要求4所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，组分C通过如下方法制备得到：

（i）将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配置50 μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1 mM的氯化锰水溶液；

（ii）取25 μL 50 μM的钙黄绿素溶液与10 μL 1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

8.权利要求1所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物或权利要求2～7任一项所述的PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒在制备检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的产品中的应用。

9.一种PSR等温扩增反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，所述的方法为非疾病诊断的实验研究方法，其特征在于：

利用如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的检测引物进行PSR等温扩增反应，检测待检样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌； 具体包括如下步骤：

（1）提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

（2）分别建立检测femA及mecA的聚合酶螺旋反应体系，于65℃水浴中保温40～45分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，所述的聚合酶螺旋扩增反应体系为26 μL反应体系：2×反应缓冲液12.5 μL，50 μM的检测引物Ft和50 μM的检测引物Bt各0.8 μL，DNA模板2 μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1 μL，加水补足至25 μL；最后加入1 μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；

（3）待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如其中一个反应管颜色为黄色或两个反应体系都未变色，说明待检样品中不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如两个反应管颜色全部变为绿色，说明待检样品中含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。