[发明专利]模拟血浆基质的循环肿瘤游离DNA标准品的制备

说明书

本发明的模拟血浆基质的循环肿瘤游离DNA标准品的制备，其制备步骤为：A、通过购买天然携带基因突变的细胞株或通过基因编辑的方法获得携带基因突变的细胞株；B、裂解野生型细胞株和基因突变细胞株，使用核小体酶切或超声打断的方法获得片段化DNA；C、将野生型片段化DNA和一个或多个基因突变片段化DNA按比例混合，使混合物具备需要的基因突变点和突变频率；D、配制模拟血浆；E、将步骤4中的混合物投入到模拟血浆中，充分混匀，并对性能进行验证。本发明提供接近人天然的ctDNA样本的标准品，为循环肿瘤游离DNA检测平台，检测试剂的开发和实验室检测能力的评价提供了标准参考物质。

技术领域

本发明涉及生物科技领域，具体涉及模拟血浆基质的循环肿瘤游离DNA标准品的制备。

背景技术

目前，肿瘤已成为全世界范围内发病率和致死率最高的疾病，其严重的威胁人类健康及生存。因此，早期诊断对改善患者预后至关重要。肿瘤发生过程中存在各种基因的突变，检测患者存在的突变类型不仅有助于了解肿瘤的发生机制，而且也可以作为分子标记用于肿瘤的易感性评估和诊断。当前临床中肿瘤基因突变检测多采用新鲜组织和石蜡包埋组织，其检测结果能为患者作指导治疗，但是也存在一些问题：(1)局部取材不能反映肿瘤异质性。(2)需要由病理医生配合取材且选取有癌细胞的组织成分。(3)组织检测不能实行动态监测。因此早期诊断、实时监测肿瘤且微创的检测方法亟待开发。

随着科学发展，“液态活检”逐渐应用于临床。血液中循环DNA，也称为游离DNA(Cell-free DNA，cfDNA)，主要来源于细胞的凋亡、坏死和分泌。在临床中血液cfDNA水平反映各种生理和病理过程，例如：孕妇的产前诊断、地中海贫血、肿瘤的预后等。近期国内外研究人员均报道cfDNA与肿瘤的发生发展相关。癌症患者cfDNA主要源于癌细胞，来源于癌细胞的游离DNA称为循环肿瘤游离DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，血液ctDNA基因突变检测相比较组织具有显著优势：取材方便且能反映肿瘤异质性、可以进行实时监测肿瘤基因动态突变状态。根据国内外近期研究报道，ctDNA基因突变在临床中的应用主要有：肿瘤诊断、指导治疗、预后评价、肿瘤复发和转移的监测。

ctDNA基因突变检测方法大致分为两种，一种是以聚合酶链式反应(polymeasechain reaction，PCR)为基础的扩增方法；另一种是与下一代测序(next generationsequencing，NGS)相关的检测方法。在这两种方法的基础上学者们又研发了许多基因突变的检测方法，如突变富集PCR技术、多路复用PCR技术、高通量平行测序和聚合酶链式反应—限制性片段多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术、BEAMing技术、数字PCR技术等。上述技术方法的软硬件和试剂开发，实验室检测能力评估需要标准物质去衡量，所以模拟血浆基质的循环肿瘤游离DNA标准品亟待开发。

发明内容

本发明的目的在于提供接近人天然的ctDNA样本的标准品，为循环肿瘤游离DNA检测平台，检测试剂的开发和实验室检测能力的评价提供了标准参考物质。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

1、通过购买天然携带基因突变的细胞株或通过基因编辑的方法获得携带基因突变的细胞株；

2、裂解野生型细胞株和基因突变细胞株，使用核小体酶切或超声打断的方法获得片段化DNA；

3、将野生型片段化DNA和一个或多个基因突变片段化DNA按比例混合，使混合物具备需要的基因突变点和突变频率；

4、配制模拟血浆；

5、将步骤4中的混合物投入到模拟血浆中，充分混匀，并对性能进行验证。

通过上述技术方案与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、可任意设定需要的基因突变位点；