[发明专利]HPV全长基因组质控品的制备方法、扩增引物及检测试剂

说明书

本发明涉及一种HPV全长基因组质控品的制备方法、扩增引物及检测试剂。其中，HPV全长基因组质控品的制备方法包括以下步骤：(1)获得DNA模版；(2)采用扩增引物进行PCR扩增；(3)采用HD Cloning连接技术将目的DNA片段与载体连接；(4)将质粒导入至感受态细胞中，然后提取质粒；(5)采用人基因组稀释质粒。本发明的人乳头瘤病毒全长基因组质控品的制备方法可成功地得到无生物传染危险型而又可模拟临床样本、可大量生产、浓度可控、稳定保存的HPV基因检测质控品，具有较好的适用性。

技术领域

本发明涉及基因检测技术，特别涉及一种HPV全长基因组质控品的制备方法、扩增引物及检测试剂。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一组无包膜的小DNA病毒，属乳头瘤病毒科。HPV病毒的形态特征通常为直径52-55nm的正二十面体。其基因组DNA长度约8000bp，基因组从功能上分为3个部分：包括早期转录区(编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等早期蛋白，参与病毒的复制、转录、翻译调控和转化等功能)、晚期转录区(编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，用于病毒组装；其中L1约占衣壳蛋白的80％，高度保守，L2含量较少，变异较多)和长控制区(long control region，LCR，含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所需的调控元件，调控病毒的转录与复制)。

目前已有HPV基因型别100余个，近33％的基因型与生殖道损伤有关，临床上根据HPV的致癌能力分为低危型与高危型HPV。低危型HPV感染主要引起尖锐湿疣，而高危型HPV持续感染则已被确认为导致宫颈病变的主要原因。综合文献报道，高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82，共18种HPV，常见低危型包括HPV6、11等。

由于HPV不能在传统的细胞培养液中培养，其它经典的直接病毒学诊断技术，例如电子显微镜和免疫组织化学，对于HPV的常规检测来说，敏感性和特异性不佳，因此，所有目前用于诊断的HPV检测试剂主要依赖于病毒核酸检测。目前临床常见的HPV检测方法有PCR-反向点杂交法、PCR-荧光探针法、杂交捕获法、流式荧光杂交法、表面等离子谐振法、PCR-质谱法等。常见的靶序列有L1、E6、E7及E1等区域，部分试剂盒的靶序列为整个HPV基因组。

HPV分型和检测试剂种类较多，具有不同的原理和特点，分析敏感性、特异性等性能指标也各有差异。国家和政府应当建立相应的与国际标物溯源的标准物质、样本盘或者质控品，对已有的和不断产生的新的试剂进行分析敏感性、临床敏感性、重复性等性能指标进行评价。也应当开展实验室间的室间质量评价，对实验室HPV检测或者基因分型的结果进行比对，以提高实验室的检测水平。

英国国家生物学标准品和质控品研究所研究建立了HPV16和18国际标准物质，世界各国均可依据该国际标准物质进行溯源得到其国家标准物质，相应的HPV基因分型试剂厂家亦可依据该国际标准物质或据其溯源的国家标准物质，建立具有统一且可比量值单位的企业参考品，并用于每批试剂的量值溯源和批间质检，从而实现不同试剂方法间的检测结果的可比性。国际标准物质采用重组HPV全基因组质粒和人宫颈细胞系提取的HPV阴性的人基因组DNA混合物制备得到。

国际标准物质价格昂贵，数量较少，不易购买，且仅有HPV16和18这2个型别，不能覆盖其他常见的HPV型别，不能满足我国试剂标准化、实验室对试剂方法性能评价、室内质量控制和室间质量评价的需要。