[发明专利]HPV全长基因组质控品的制备方法、扩增引物及检测试剂

权利要求书

1.一种HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得HPV的DNA模版；具体为：选取感染单一型别HPV的宫颈脱落细胞，通过PCR-反向点杂交法确定HPV型别，然后通过荧光PCR测定HPV的DNA浓度，选择Ct值在25以下的样本作为DNA模版；

(2)采用扩增HPV全长基因组的扩增引物进行PCR扩增，获得包含HPV全长基因组的目的DNA片段，将获得的目的DNA片段进行纯化；所述扩增HPV全长基因组的扩增引物包括用于扩增HPV16型、HPV18型、HPV26型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV53型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV73型、HPV82型、HPV 6型、HPV 11型、HPV 42型、HPV 43型和HPV 81型全基因组的扩增引物，其核苷酸序列如SEQID No.1-46所示；所述引物的5’端增加与载体序列同源的15bp片段；

具体对应关系如下所示；

采用如上所述的HPV全长基因组扩增引物进行PCR的PCR反应体系如下所示：

扩增程序如下所示：

94℃下1min，1个循环；98℃下10sec且58℃下15sec且68℃下5min，60个循环；68℃下10min，1个循环；

所述PCR反应体系和扩增程序为每对引物针对单一型别HPV的DNA模版单独进行扩增；

(3)采用HD Cloning连接技术将目的DNA片段与载体连接，构建获得质粒；

(4)将质粒导入至感受态细胞中，然后提取质粒并验证质粒与HPV各基因型别的序列是否匹配；

(5)采用人基因组稀释质粒，获得所述HPV全长基因组质控品。

2.根据权利要求1所述的HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，还包括步骤(6)：采用所述HPV全长基因组质控品、用于数字PCR检测HPV全长基因组的试剂中的数字PCR引物和探针，进行PCR反应；

所述用于数字PCR检测HPV全长基因组的试剂的数字PCR引物和探针包括用于检测HPV16型、HPV18型、HPV26型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV53型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV73型、HPV82型、HPV 6型、HPV11型、HPV 42型、HPV 43型和HPV 81型的数字PCR上游引物、下游引物和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.47-48、SEQ ID No.49-50和SEQ ID No.51所示。

3.根据权利要求2所述的HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记MGB。

4.根据权利要求2所述的HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，步骤(6)中的PCR反应的反应体系为：

5.根据权利要求4所述的HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，步骤(6)中的PCR反应的扩增程序为：95℃下10min，1个循环；98℃下30sec且58℃下60sec，40个循环。

6.根据权利要求1所述的HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，测量获得的HPV全长基因组质控品的核酸浓度。

7.根据权利要求1所述的HPV全长基因组质控品的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将获得的质粒于50℃条件下孵育15min，然后置于冰上。