[发明专利]一种数字PCR引物及其定量检测副干酪乳杆菌含量的用途

说明书

本发明公开了一种数字PCR引物及利用该引物定量检测副干酪乳杆菌含量的方法体系。本发明构建了微滴式数字PCR技术应用到定量检测副干酪乳杆菌的体系方法，利用死细菌去除方法，结合ddPCR技术的精准定量，开发出定量检测方法，为生产企业的过程控制提供必要的技术保障，也为ddPCR技术在其它污染菌和致病菌的检测推广奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种定量检测副干酪乳杆菌含量的数字PCR引物及其检测技术方法。

背景技术

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)为乳杆菌属干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的一个亚种，常被用作酸奶和干酪等乳制品的发酵剂或辅助发酵剂，是近年来研究较多的一种益生乳酸菌。副干酪乳杆菌菌数作为一个重要的数据需要反复的检测，然而传统的菌数检测方法繁琐检测周期较长难以满足现代工业生产的需求。

数字PCR(Digital PCR,d的PCR)作为第三代PCR的技术代表，由Vogelstein等提出。ddPCR是把一个样本的反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，独立地进行PCR扩增，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布以及荧光信号阳性的反应单元数量占所有反应单元的比例，来计算目的核酸序列的拷贝数，ddPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。目前，该技术已经在稀有突变检测、CNV分析和复杂样本基因表达检测等方面有着广泛的应用。目前尚未见利用微滴式数字PCR法定量检测副干酪乳杆菌的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种数字PCR引物及利用该引物定量检测副干酪乳杆菌含量的方法体系。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种数字PCR引物，包含：上游引物如SEQ ID NO：1所示、下游引物如SEQ ID NO：2所示。

本发明还涉及包含上述数字PCR引物的检测试剂盒。

本发明还涉及上述数字PCR引物用于定量检测副干酪乳杆菌含量的用途。

以上述数字PCR引物为基础，采用微滴式数字PCR方法定量检测副干酪乳杆菌的含量。

作为本发明的一种优选技术方案，上述微滴式数字PCR方法包含如下步骤：

A、DNA的提取：取待测样品并提取其中的DNA，保存备用；

B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用权利要求1记载的引物；

C、ddPCR反应体系的建立：2-50μL 2×混合液，引物稀释到5-50μmol/L，上游引物和下游引物各加入0.5-5.0μL，将模板DNA加入2-10μL，用ddH₂O补至10-50μL；

D、ddPCR检测方法的建立：将充分混匀的PCR反应体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入10-100μL Droplet Genera-tion Oil，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应；随后将生成的微滴转移到ddPCR的96孔中，用封膜仪对96孔板封膜，准备进行PCR反应；ddPCR的反应程序：95℃预变性，10min；94℃变性，1min；56℃退火，45s；进行40个循环，98℃10min；

E、检测结果的获取：ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200 Droplet Reader，依次录入样品信息，检测开始后仪器会按顺序自动识别每个样品的微滴，在微滴读取油的配合下微滴依次通过双色检测器，根据微滴发出的荧光信号的强度判定阳性和阴性结果，并记录下每个样品的阳性和阴性的微滴数；信号采集完毕后，软件Quantasoft将计算出最终结果并以图像的形式给出。