[发明专利]一种数字PCR引物及其定量检测副干酪乳杆菌含量的用途

权利要求书

1.一种数字PCR引物，其特征在于：所述PCR引物包含：上游引物如SEQ ID NO：1所示、下游引物如SEQ ID NO：2所示。

2.包含权利要求1所述数字PCR引物的检测试剂盒。

3.权利要求1所述数字PCR引物用于定量检测副干酪乳杆菌含量的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：采用微滴式数字PCR方法定量检测副干酪乳杆菌的含量。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述微滴式数字PCR方法包含如下步骤：

A、DNA的提取：取待测样品并提取其中的DNA，保存备用；

B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用权利要求1记载的引物；

C、ddPCR反应体系的建立：2-50μL 2×混合液，引物稀释到5-50μmol/L，上游引物和下游引物各加入0.5-5.0μL，将模板DNA加入2-10μL，用ddH₂O补至10-50μL；

D、ddPCR检测方法的建立：将充分混匀的PCR反应体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入10-100μL Droplet Genera-tion Oil，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应；随后将生成的微滴转移到ddPCR的96孔中，用封膜仪对96孔板封膜，准备进行PCR反应；ddPCR的反应程序：95℃预变性，10min；94℃变性，1min；56℃退火，45s；进行40个循环，98℃10min；

E、检测结果的获取：ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200 Droplet Reader，依次录入样品信息，检测开始后仪器会按顺序自动识别每个样品的微滴，在微滴读取油的配合下微滴依次通过双色检测器，根据微滴发出的荧光信号的强度判定阳性和阴性结果，并记录下每个样品的阳性和阴性的微滴数；信号采集完毕后，软件Quantasoft将计算出最终结果并以图像的形式给出。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤A中，DNA提取的具体操作方法为：取0.5μL浓度为10mg/mL的PMA溶液加入到1mL菌悬液中，PMA终浓度为5μg/mL，充分混匀后，室温避光5min；用500W卤素灯曝光5min，且光源距离心管的垂直距离为20cm；曝光期间离心管置于冰上并持续摇晃离心管，避免局部过热和保证反应充分；曝光结束后12000r/min离心5min，弃上清，无菌水洗涤2次后重悬备用；使用细菌基因组DNA提取试剂盒对上述菌体DNA进行提取后-20℃保存备用。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤C中，所述模板DNA用量为4μL；上游引物和下游引物的用量为1.2μL，引物稀释到10μmol/L。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤C中，所述2×混合液为2×EvagreenqPCR Master Mix，用量为10μL；所述ddH₂O补齐至20μL。

9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤D中，所述Droplet Genera-tion Oil的用量为70μL。

10.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：检测完成后，利用微滴检测仪验证ddPCR对副干酪乳杆菌检测的特异性和灵敏度进行验证。