[发明专利]一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒，包括两条特异性引物，所述试剂盒还包括M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2⁺和PCR反应缓冲液。本发明还提供一种甘薯病毒的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA，(2)设计并合成引物，(3)RT‑PCR，(4)电泳检测。本发明提供了一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒与检测方法，利用RT‑PCR方法检测甘薯中褪绿矮化病毒，克服了分离病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为甘薯病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒及其检测方法。

背景技术

甘薯是重要的粮食作物、食品加工原料和新型能源作物。我国甘薯种植面积位居世界第一。病毒病对甘薯产业造成很大影响。研究表明，我国甘薯样品上至少存在羽状斑驳病毒属Sweet potato feathery mottle virus(SPFMV)、褪绿矮化病毒Sweet potatochlorotic stunt virus(SPCSV)等20余种病毒。SPCSV与SPFMV共同侵染可引起甘薯复合病毒病(Sweet potato virus disease，SPVD)，该病可使甘薯减产50％-98％，甚至绝收。

2010年，Qiao等首次报道了SPCSV在我国发生。2012年，张正臣等首次证明我国已发生SPVD。近年来，SPCSV在我国的发生面积逐渐扩大，在全国范围内迅速蔓延，对甘薯的危害日趋严重，是甘薯上危害最严重的病毒之一。

由于甘薯样品中存在多种病毒复合侵染的现象，采用传统的血清学、PCR等方法对症状表现明显的病毒病原进行鉴定不能完整地反映样品中的病毒，故亟需一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒及其检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒与检测方法。

技术方案：本发明所述的一种用于甘薯中褪绿矮化病毒鉴别诊断的试剂盒，包括两条特异性引物：

SPLVGV-1：5’-TGTAACGAAAGGGACTAGTGCAAGG-3’；

SPLVGV-2：5’-CCGCTATGAGTAAGTCCTGCACAAGC-3’。

进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。

进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明中还提供一种甘薯病毒的检测方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品总RNA；

(2)设计并合成引物；

(3)RT-PCR

a.反转录合成cDNA，以总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA

b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR反应；

(4)电泳检测

吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该甘薯病毒的样品中有895bp的核酸条带。

进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。