[发明专利]用于检测等位基因HLA-B*5801的肽核酸引物组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测HLA‑B*5801等位基因的引物组合物、试剂盒及方法，所述HLA‑B*5801等位基因的引物组合物包括：正向引物：5’‑ACGGAACTTGAAGGCCT‑3’；反向引物：5’‑TAGCACTCACCATGTAGTTGAGGTC‑3’；MGB荧光探针：5’‑VIC‑GATCCGCCTCACTGA‑MGB‑3’，PNA探针：AGCTCCTGA。本发明实施例依据特异性的引物与探针实时检测PCR反应过程，检测过程仅需1h，可一次性检测96个样本或是384个样本，简单易行且通量较高；本发明添加了适量的氯化四甲基铵(TMAC)作为反应添加剂，对浓度较低的核酸也均有很好的检测效果；本发明只需要一对引物与PNA探针、MGB探针组合共同检测目的基因，控制了试剂成本，且可以准确区分HLA‑B*5801基因型与其他相似度较高的HLA‑B*58亚型，即使未来发现新的HLA‑B基因型别也可以依据具体情况补充PNA探针，经济适用，适合大规模生产。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测等位基因HLA-B*5801的肽核酸引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

近年来，痛风的发病率呈上升趋势，我国普通人群患病率约1.14％。痛风发病的生化基础是高尿酸血症，别嘌呤醇用于减少尿酸合成，降低血液中的尿酸浓度，是治疗痛风的首选药物，临床应用较为广泛。在服用别嘌呤醇时，可导致严重药疹，相关报道屡见不鲜，有研究称别嘌呤醇是最容易引起药疹的药物之一。别嘌呤醇诱发的皮肤不良反应主要包括Stevens-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)，死亡率分别可达5％和35％。大量研究表明别嘌呤醇引发的SJS和TEN具有一定的个体差异性。研究发现，服用药物别嘌呤醇后发生不良反应的痛风患者中，患者HLA-B*5801等位基因携带率为100％，而在正常对照人群与耐受组中，该型别的携带率分别为20％与15％。HLA-B*5801等位基因与服用别嘌呤醇发生不良反应的相关性最早是在针对汉族人群的一项研究中发现，后续研究再次证实了这一相关性发现。然而，对于与HLA-B*5801序列几乎一致的其他HLA-B*58亚型是否与别嘌呤醇不良反应同样相关存在一定争议。随着相关研究的不断深入，这一结论多次得到证实。2008年，中国台湾地方行政部门发布指令，在服用药物别嘌呤醇之间必须进行HLA-B*5801检测。2012年美国风湿病协会痛风治疗指南中也强调了这一检测的必要性与重要性。

HLA(human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)系统包含一系列基因座位，位于人类第六号染色体的短臂，是目前所知人体最复杂的多态系统。依据表达特性、组织部位以及产物结构等特征，HLA基因家族可分为三类抗原，其基因序列差异较小，鉴别较困难。目前已发现并命名的HLA等位基因已经达到5000多个。鉴于HLA系统的高度多态性与同源性，各等位基因之间序列相似性较高，发明一种广泛适用的方法鉴定某一HLA等位基因型别具有一定的技术难度。

目前所应用的检测HLA-B*5801等位基因的方法主要有PCR-SBT(测序法)、PCR-SSP(序列特异性引物法)和RT-PCR(实时荧光PCR法)。PCR-SBT直接对HLA-B基因座位进行测序，检测步骤较为繁琐且设备昂贵，耗时较长，部分基因检测实验室难以达到要求，不适合大规模推广。PCR-SSP通过电泳的方式检测PCR产物，需要开盖，容易污染实验室环境，且灵敏度较低。此外，也采用RT-PCR检测HLA-B*5801等位基因的试剂盒以及检测方法，该检测试剂盒以及检测方法中，为了提高基因检测特异性，避免漏检或者假阳性，通常是针对HLA-B*5801等位基因设计多对引物探针，对HLA-B*5801等位基因上的多个区段进行设计引物实施RT-PCR检测，这样需要采用多对引物探针，或是采用多个体系检测，造成对产品的检测成本高、操作过程繁琐，使用不方便等问题，并且难以区分HLA-B*58其他亚型，易产生假阳性。依靠增加引物对来提高检测的特异性显然是不现实的。此外，市面上的引物检测试剂盒相关，也缺乏大样本量与金标准(测序分型)方法的比对数据。