[发明专利]一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒

说明书

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒。本发明的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μL PCR酶，140μL DL2000 Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μL TE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’‑ACGTGACTACTTCACCCTGAT‑3’，所述下引物序列为：5’‑TAGACCGACTATTTCACCTTC‑3’，它可从牛肺、鼻拭子临床样本中直接检测到牛支原体病病原核酸，试剂盒的灵敏度为1pg，整个检测过程从开始到出结果仅需3.5小时。本发明的试剂盒具有快速、灵敏性高、特异性强等特点，且不需要考虑菌体死活、抗体产生等因素，对牛支原体感染的诊断、防治与预后评估具有重要意义。

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒。

背景技术

牛支原体是危害养牛业的一种重要的致病性支原体，除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还导致角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。

1961年，美国人Hale首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体，1976年报道其与牛呼吸系统疾病有关。目前，该病原在世界范围内普遍存在。欧洲每年约有25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44～1.92亿欧元，其中英国每年有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.40亿美元，牛场感染率可达70％。

在我国，自2008年以来，我国大部分省地区新从外地引进肉牛爆发了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情，多数牛在运输到目的地后1～2周左右发病，发病率为50％～100％，病死率高达10％～50％，给我国肉牛养殖业造成了巨大的经济损失。随着我国肉牛养殖规模的不断壮大，北牛南运、北繁南育，引进国外种牛日益普遍，肉牛的各种疾病也随之而来，肉牛支原体病的发生呈逐年上升趋势。而大多数的肉牛支原体病伴有多病原混合感染现象出现，临床上难以及时鉴别诊断，细菌学培养分离鉴定，程序繁琐、培养周期长，免疫学诊断虽然操作简单，但具有抗体依耐性，特别是在感染早期，血清中抗体水平低，检测的敏感性低，达不到早期诊断的目的，延误防治时机，给肉牛业造成巨大的经济损失。而PCR诊断技术具有敏感、特异的特点，能快速、准确地检测病原核酸，且不考虑菌体死活、抗体产生等因素，并可对疾病早期进行诊断，为防治该病争取到了最佳的治疗时机。

因此，寻找一种快速、灵敏性高、特异性强的牛支原体病PCR快速诊断试剂盒是当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，具体是通过以下技术方案得以实现的：

一种牛支原体病PCR快速诊断试剂盒，该试剂盒包括：4000μL TBS液，800μL蛋白酶K，3200μL裂解液，24mL漂洗剂，200μL PCR酶，140μL DL2000Marker，20μL上引物，20μL下引物，40μL阳性对照，40μL阴性对照，1200μL TE缓冲液，20个吸附柱；引物浓度为20μM，漂洗剂用时现配，所述上引物的序列为：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3’，所述下引物序列为：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3’。

所述TBS液，是10mmoL/L的Tris含0.9％NaCL，用1N HCl调pH至7.4。

所述蛋白酶K，用TE溶液配制成20mg/mL的溶液。

所述裂解液，是由10mM Tris-HCL、1mM EDTA、2.5M NaCL以及占裂解液总体积5％的SDS组成的混合溶液。