[发明专利]重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌固定化细胞及在利用木糖母液生产木糖醇中的应用，所述固定化细胞是将木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因共同导入宿主大肠杆菌，获得含有双酶基因的重组大肠杆菌，然后将重组大肠杆菌进行发酵培养，取湿菌体细胞进行固定化，获得重组大肠杆菌固定化细胞。本发明重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet‑1‑XR‑GDH实现了木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达，其双酶偶联体系不需要额外的辅酶添加，生产方法简单、高效，时空产率远高于发酵法，木糖母液中木糖转化率达到99％以上，利用葡萄糖为辅底物，该重组细胞催化200g/L木糖，反应30h后，木糖醇产率为100％。

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌株及其在利用木糖母液生产木糖醇中的应用，属于生物催化技术领域。

背景技术

木糖母液是以玉米芯、甘蔗渣等生物质资源利用化学法生产木糖后剩余的废糖液，是木糖结晶后留下的颜色较深的粘稠液体，一般来说木糖母液中含有约50～60％的糖，里面含有木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等，其中木糖含40～50％左右。由于生产工艺的原因，木糖母液粘度较大，使得木糖母液无法再次通过浓缩结晶利用单糖。通常情况下，每生产1吨木糖约产生1.5吨木糖母液，其价格低廉，利用率低，造成大量的资源浪费和严重的环境污染，因此木糖母液具有较强的开发应用潜力。目前已有学者通过化学法或者发酵法利用木糖母液，但由于工艺复杂，成本高，产品低廉，因此并未实现工业化大规模应用。中国专利CN104086607B公开了一种从木糖母液中生产L-阿拉伯糖的方法，其利用酵母发酵去除葡萄糖，然后利用色谱分离法获得L-阿拉伯糖和木糖组分，分别结晶得到阿拉伯糖和木糖产品，该方法的缺点在于使用酵母去除葡萄糖的操作复杂，并且木糖利用价值与木糖醇相比较低。中国专利CN102603814B公开了一种提高木糖母液中结晶效率的方法，其中利用酵母发酵去除葡萄糖和半乳糖，然后膜分离去除胶体、蛋白等杂质，得到主要含木糖和阿拉伯糖的清液，该方法存在发酵步骤较复杂，并且产物附加值较低，限制了其应用范围。中国专利CN107384815A公开了一株酿酒酵母工程菌株，通过发酵法利用木糖母液生产木糖醇，发酵60h后转化率达到理论值100％，该方法存在发酵周期过长，菌体重复使用困难，时空产率较低，不能达到工业化生产的要求。

相比较于化学法与发酵法，生物转化法具有反应条件简单，生产效率高等优势，因此利用生物转化法实现木糖母液的回用是一种颇有前景的方法。通过具有高催化活性的木糖还原酶催化木糖母液获得木糖醇，再根据糖醇性质差异，从转化液中分离回收木糖醇与阿拉伯糖，大大提高了木糖母液的附加值，并且解决了木糖和阿拉伯糖难于分离的问题。同时固定化技术的开发应用可以有效稳定生物催化剂酶活，提高操作稳定性，降低生产成本，提高利用。发明人构建了一株木糖还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-1-XR-GDH，木糖还原酶(Xylose Reductase，XR，Rhizopus oryzae AS3.819)与葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase，GDH，Exiguobacterium sibiricum 255-15)构成辅酶循环体系，无需额外添加昂贵的辅酶，实现胞内辅酶循环，该菌株具有高效催化木糖制备木糖醇的活性，基于该重组菌建立的固定化细胞催化木糖母液制备木糖醇的工艺，可实现木糖母液的高效利用，具有较好的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株重组大肠杆菌及其在利用木糖母液生产木糖醇中的应用。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种重组大肠杆菌固定化细胞，所述固定化细胞是将木糖还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因共同导入宿主大肠杆菌，获得含有双酶基因的重组大肠杆菌，然后将重组大肠杆菌进行发酵培养，取湿菌体细胞进行固定化，获得重组大肠杆菌固定化细胞。

进一步，所述木糖还原酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。