[发明专利]一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种对卡耶塔环孢子虫进行快速分型和溯源的定量PCR方法，采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组不同拷贝间的多态性连接区域作为遗传标记，设计了特异性的定量PCR引物，包含上游引物Cyc‑Mito‑F1和下游引物Cyc‑Mito‑R1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。本发明方法克服了现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法对该病原进行精细分型的缺点，而且扩增效率比现有的单位点分子诊断工具高；本发明采用卡耶塔环孢子虫线粒体基因组上的单个位点定量PCR和熔解曲线分析就可进行快速的基因型区分和溯源，克服了现有的卡耶塔环孢子虫多位点序列分型工具中因需要对多个位点扩增和测序所导致的分型耗时长、成本高的缺点，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种用于卡耶塔环孢子虫快速分型和溯源的定量PCR方法及试剂盒。

背景技术

卡耶塔环孢子虫是一种重要的食源性传播病原，该病原进入人体后主要引起以腹泻为主的环孢子虫病，尤其在儿童和免疫缺陷病病人中常会造成持续性腹泻。环孢子虫病最早发现于秘鲁、危地马拉和尼泊尔等发展中国家，并且在这些国家呈地方性流行。但近年来，随着旅游业和食品供应的不断全球化，环孢子虫病传播到非环孢子虫病流行地的机会急剧增加。在过去的20年中，北美地区几乎每年都会出现大规模的环孢子虫病暴发，而且这些暴发主要与从环孢子虫病流行地进口的新鲜果蔬有关，因此卡耶塔环孢子虫已对公共卫生安全和食品安全造成了巨大威胁。我国对环孢子虫病的研究起步相对较晚，虽然目前还没有环孢子虫病暴发报道，但我国作为进口水果的高消费国家，每年从包括危地马拉、秘鲁等环孢子虫病流行地进口大量的新鲜果蔬(在2014～2016年间，我国平均每年进口水果总量高达350余万吨)，因此也存在环孢子虫病大规模暴发的风险。所以，亟需可精细区分卡耶塔环孢子虫的分型工具，以确定暴发的发生以及污染来源。

现有的卡耶塔环孢子虫单位点分子诊断工具无法用于该病原的基因型区分。在卡耶塔环孢子虫全基因组测序完成之前，针对该病原的分子诊断工具几乎都是基于该病原核基因组的核糖体小亚基RNA(Small Subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因、70kDa热休克蛋白(70kDa Heat Shock Protein，HSP70)和内转录间隔区(Internal TranscribedSpacer，ITS)建立的，其中前两者在该病原中高度保守，而ITS区域在同一虫株的不同拷贝之间就存在明显的序列差异。因此，基于这些位点建立的单位点分子诊断工具均无法用于该病原的基因型区分。而卡耶塔环孢子虫全基因组测序的完成使该病原高分辨率分型工具的建立成为可能。最近，中国源和美国源的卡耶塔环孢子虫虫株的全基因组测序相继完成，基于获得的全基因组序列，已建立了一种具有高分辨率的多位点序列分型工具(Multilocus Sequence Typing，MLST)，但该工具需通过对多个位点进行扩增和测序来实现分型，所以检测成本较高，且耗时耗力。

定量PCR(quantitative PCR，qPCR)是目前应用最广泛的分子诊断工具之一，该方法通常采用荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，不仅检测方法简单，且成本低。在PCR反应中，荧光染料特异性地结合在双链DNA上，随着PCR反应的进行，双链DNA反应产物不断增加，荧光信号强度也等比例增加，通过对PCR反应中每一个扩增循环产物的荧光信号进行实时检测，可实现对起始模板定性及定量分析。此外，扩增结束后逐渐增加温度使双链DNA逐步解链，荧光染料会从解链的DNA分子上释放，荧光强度降低，在解链过程中熔解温度将会出现一个特征峰值Tm(DNA双链解链50％的温度)，并且若起始模板的DNA序列、长度、GC含量之间存在差异，其对应产生的Tm值也会有所不同。因此，根据熔解曲线的峰形和Tm值即可以快速、准确地对待测样品进行序列多态性分析和基因型鉴定。作为一种快速、灵敏且经济的诊断技术，qPCR结合熔解曲线分析已被广泛应用于突变分析和基因分型。

目前，还未见有采用qPCR对卡耶塔环孢子虫进行快速分型和溯源的方法。

发明内容