[发明专利]一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用

说明书

本发明公开了一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用，其中真菌漆酶突变体PIE5，是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶Lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。本发明真菌漆酶突变体PIE5最适催化pH为8.5(愈创木酚为底物)，而且在pH至9.5时仍能够发挥良好活性，因此真菌漆酶PIE5相比之下具有碱性环境的应用优势，扩宽了真菌漆酶的应用领域，可直接应用于纺织整染工艺代替石磨水洗，在废水靛蓝降解中也无需调整废水pH，有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。

技术领域

本发明涉及一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化多种底物如酚类、芳胺类等氧化，当一些小分子物质作为介体存在时，漆酶能够进一步拓宽其氧化底物，并同时将O₂还原成水。漆酶分布广泛，在植物、动物和微生物等当中均有分布。其中，微生物是漆酶的最主要来源物种。一般情况下，真菌漆酶具有较高的氧化还原电势(470-790mV)，以及较高的比活力(100-1,000 U/mg)。相比较，细菌漆酶氧化还原电势较低(340-490mV)，比活力也低于真菌漆酶(0.1-10 U/mg)。因此，真菌漆酶具有更广泛的应用价值。

由于真菌漆酶具有宽泛的底物特异性，它们在纸浆漂白、生物修复、染料降解、药物合成及生物降解等多种领域均有应用，具有重要的经济价值。目前，真菌漆酶在纺织整染特别是靛蓝脱色中应用最为广泛。在牛仔布的整染过程中，真菌漆酶可用于浮石洗涤过程，也可以用于后期的靛蓝降解过程。由于真菌漆酶仅能在酸性条件下发挥最佳活性(pH值3-5)，而在中性或碱性条件下，真菌漆酶虽然比较稳定，但是几乎无活力。因此，在牛仔布的整染过程中，需要将洗涤的pH值控制在5左右，而在反应结束后，需要将废水的pH调整到中性，这一过程增加了洗涤的成本，同时提高了水中的盐离子的浓度，不利于后期处理和环境保护。通过蛋白质工程改造，获得能在中性或碱性条件下发挥良好活性的真菌漆酶蛋白，将有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。

发明内容

本发明基于现有技术的缺陷，旨在提供一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用。

本发明真菌漆酶突变体PIE5，是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶Lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。

本发明真菌漆酶突变体PIE5，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明真菌漆酶突变体PIE5，其氨基酸序列为SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

表达本发明真菌漆酶突变体PIE5的菌株，含有耐受碱性pH的真菌漆酶蛋白的编码基因，分类命名为Pichia pastoris pPIC9K-PIE5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2018年7月19日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018451。

本发明真菌漆酶突变体PIE5的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将菌株Pichia pastoris/pPIC9K-PIE5接种于种子液体培养基中进行发酵，在 15-35℃、100-250rpm/min条件下培养至菌体OD₆₀₀＝2～6；将菌体离心后，用发酵液体培养基重悬细胞至OD₆₀₀＝0.5-2.0，每隔24h加入甲醇使其中甲醇浓度为0.3-2.0％；将诱导后的发酵液离心后获得上清液，即为真菌漆酶粗酶液；