[发明专利]一种用于高核酸酵母选育的高通量筛选体系及应用

说明书

一种用于高核酸酿酒酵母选育的高通量筛选体系，是由报告质粒YEp‑Hyg B‑yeGFP和含有YEp‑Hyg B‑yeGFP的宿主细胞构成；报告质粒YEp‑Hyg B‑yeGFP为环状，从5’到3’依次由YEplac195质粒骨架、酵母增强型绿色荧光蛋白基因yeGFP表达盒、潮霉素B抗性基因表达盒组成；宿主细胞的出发菌株是经筛选确认核酸含量高于正常值的酿酒酵母工业菌株。本发明还公开了筛选体系在高核酸酵母工程菌选育中的应用。该筛选体系可弥补传统的高核酸酵母育种无法直接反映RNA含量的缺陷，并可借助其在酵母中的不稳定性，通过连续传代即可轻易消除，对高核酸酵母在食品行业中的应用具有重要意义。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于高核酸酿酒酵母选育的高通量筛选体系及应用。

背景技术

核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)不仅在细胞内执行生物学功能，而且也是重要的新食品原料、食品添加剂和医药中间体等。RNA及其降解物、或相应的衍生物是多种药物的有效成分[王楠,蔡夏夏,李勇.外源核苷酸与免疫功能研究进展.食品科学,2016,37(5):278-282.]，对人与动物的保健功效、免疫力提高等方面具有积极作用。近年来，RNA经多酶促定向转化制备的5’-肌苷酸(5’-IMP)和5’-鸟苷酸(5’-GMP)，被称为呈味核苷酸二钠，具有独特的“鲜味”口感和富含营养的特性，已经成为新一代的强化营养保健型核苷酸类食品增味剂，具有很高的经济价值。

核糖核酸是生命存在的物质基础，几乎所有的生物体都含有核糖核酸，但并不是所有的生物资源都可以用来大规模提取核糖核酸，存在核糖核酸含量低、资源有限或工业上无法制备等问题。利用如枯草芽孢杆菌等微生物直接发酵产RNA虽然具有工业化价值，但由于RNA是大分子物质，发酵液粘度高，目前从发酵液中提取RNA在技术上仍有很大难度，限制了其工业化生产[乔宾福.微生物产生核苷和核酸[J].工业微生物,1998,(28):22-27.]。而作为食品安全级(Generally Regarded As Safe，GRAS)微生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是公认最理想的RNA源，不仅其RNA含量相对较高，而且抽提后的菌体蛋白质仍具有很高的应用价值，便于综合利用。目前，国外酵母核酸生产主要集中在巴西，国内一些啤酒生产厂家利用啤酒生产过程中产生的废酵母提取RNA虽然可以变废为宝，实现资源的循环再利用，但因为原料质量差，RNA含量较低，产品质量很不稳定，相对转换率低，对后续生产加工影响大，因此国内的医药厂家只能高价从国外如巴西进口大量的高含量酵母RNA产品，市场处于供不应求的局面。因此，选育高核酸酵母是势在必行，也是解决这一问题的根本。

目前，对于高核酸酿酒酵母的研究已是当今的研究热点之一，中国专利申请CN101760437A公开了一种“高核酸面包酵母及其制备方法”，该方法通过控制扩大培养的培养时间等条件，制备得到了含有相当于面包酵母菌体重量的20重量％以上的核酸，其中RNA达到了9.5％以上。中国专利申请CN102559522B公开了一种“高核酸面包酵母及其制备方法”，该方法在面包酵母扩大培养过程中添加谷氨酰胺和天冬氨酸，制备了相对于面包酵母菌体的100重量％，含有20重量％以上的核酸，其中RNA大于12.0重量％；中国专利申请CN106635851A公开了一种“高核酸酿酒酵母菌的选育方法”，该方法通过初筛和复筛后，经培养基优化，再经过小试和中试发酵工艺优化进行扩大化培养，获得RNA含量为14.6％-15.2％的高核酸酿酒酵母菌。这种传统的育种方法虽然避免了转基因问题，但RNA含量检测操作繁琐，误差较大，很难实现规模化筛选。