[发明专利]一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用

说明书

本发明涉及酶联免疫技术领域，公开了一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用。本发明以果蝇卵细胞作为表达Her2全长蛋白的宿主细胞，联合适宜的昆虫细胞表达载体、筛选方法、细胞传代扩增方法以及蛋白纯化方法组成系统的Her2全长蛋白表达纯化方法，获得了毫克级以上的目标蛋白，并具备较佳的抗原性和与抗Her2单抗结合的特异性，可通过夹心ELISA法有效识别血清中Her2的含量，对乳腺癌的诊断分型和预后有重要指导作用。

技术领域

本发明涉及酶联免疫技术领域，具体涉及一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用。

背景技术

乳腺癌细胞有三种重要受体：雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)和HER2。ER+癌细胞(即具有雌激素受体的癌细胞)依赖于雌激素的生长，可以用药物治疗以阻断雌激素效应(例如他莫昔芬)，且预后较好。HER2+癌细胞用单克隆抗体曲妥珠单抗(联合常规化疗)的药物有一定的疗效，并改善了预后。不含任何这三种受体类型的乳腺癌细胞(雌激素受体，孕激素受体或HER2)被称为三重阴性，对上述治疗不敏感且预后较差。

Her2是跨膜蛋白有膜外膜中和膜内3部分组成。癌细胞裂解Her2可释放到血清中，膜外部分可从肿瘤细胞表面脱落进入循环，这使得在血清中队HER2的检测可行。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中的HER2被广泛研究。

曲妥珠单抗是抗Her2的单克隆抗体，它通过将自己附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长。它可将1-3期HER2阳性乳腺癌的5年无病生存率提高到87％(总生存率95％)。通过测血清中Her2含量作为筛查乳腺癌的一种方式，不仅对身体无副作用，还能有助于预测对曲妥珠单抗治疗的反应对是否采取曲妥珠单抗治疗方案以直观的指示，但曲妥珠单抗不仅昂贵且对心脏毒性有关。

Her2全长蛋白由于其特殊性，难以成功的在常规细胞中表达并纯化出可用的Her2全长蛋白，目前仅有的表达Her2全长蛋白普遍是采用乳腺癌细胞株，但是采用乳腺癌细胞株表达Her2全长蛋白，只适用于一般的功能检测和课题研究，只有纳克级，而能够表达并纯化出Her2全长蛋白至少需要达到毫克级别。因此，能够成功表达并纯化出Her2全长蛋白将对检测血清中Her2含量有很重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，使得所述方法能够成功表达并纯化出Her2全长蛋白，具备较佳的抗原性，并能够和抗Her2单抗特异性结合；

本发明的另外一个目的在于提供以上述Her2全长蛋白为基础的乳腺癌检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，包括：

步骤1、合成Her2全基因，并在全基因两端设计酶切位点，通过酶切连接至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；

步骤2、将所述重组载体转染至果蝇卵细胞中，通过筛选获得稳定表达Her2全长蛋白的果蝇卵细胞；

步骤3、将所述果蝇卵细胞传代扩增至细胞浓度为2*10⁶个/ml时，离心去掉上清液，留存细胞；

步骤4、用含500uM硫酸铜诱导剂的无血清培养基重悬细胞，并诱导表达72小时，收集上清表达液；

步骤5、上清表达液进行Ni-NTA蛋白纯化，获得Her2全长蛋白。

针对目前缺少表达并纯化出Her2全长蛋白的方法，本发明选择果蝇卵细胞为表达载体，并制定了一套与之相适宜的表达载体和表达方法，最终表达并纯化出可以直接用于ELISA检测中的毫克级以上的Her2全长蛋白。