[发明专利]一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用

权利要求书

1.一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，其特征在于，包括：

步骤1、合成Her2全基因，并在全基因两端设计酶切位点，通过酶切连接至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；

步骤2、将所述重组载体转染至果蝇卵细胞中，通过筛选获得稳定表达Her2全长蛋白的果蝇卵细胞；

步骤3、将所述果蝇卵细胞传代扩增至细胞浓度为2*10⁶个/ml时，离心去掉上清液，留存细胞；

步骤4、用含500uM硫酸铜诱导剂的无血清培养基重悬细胞，并诱导表达72小时，收集上清表达液；

步骤5、上清表达液进行Ni-NTA蛋白纯化，获得Her2全长蛋白。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酶切位点为NcoI和XhoI。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述昆虫细胞表达载体为携带pac基因和His标签的昆虫细胞表达载体。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述昆虫细胞表达载体为pMT/Bip/V5-A。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述果蝇卵细胞传代扩增采用Schneider果蝇培养基培养传代扩增。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述无血清培养基为Schneider果蝇培养基。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5为：

步骤5.1、平衡Ni-NTA柱；

步骤5.2、在上清表达液里混合Tris-buffer saline并一同加入柱子，控制流速为0.5ml/min；

步骤5.3、收集滤下的样品，重复上一步骤1次或多次；

步骤5.4、Tris-buffer saline洗涤，同时测定OD_280nm，直到没有蛋白流出为止；

步骤5.5、Tris-buffer saline洗杂，收集滤液，直至OD_280nm测定没有蛋白流出为止；

步骤5.6、Tris-buffer saline洗脱，收集每管洗脱液，测定OD_280nm并电泳检测所收集的洗脱液，检测出目标蛋白，然后透析获得Her2全长蛋白。

8.一种乳腺癌夹心ELISA法检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7任意一项所述方法制备的Her2全长蛋白。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括如下组分的一种或两种以上：

包被有抗Her2单克隆抗体1的载体、PBS-T、连接酶HRP的抗Her2的单克隆抗体2和TMB。

10.一种检测Her2含量的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将权利要求1-7任意一项所述方法制备的Her2全长蛋白分别稀释为100ng/100ul、80ng/100ul、60ng/100ul、40ng/100ul梯度浓度，0ng/100ul作为阴性对照，包被有抗Her2单克隆抗体1的载体上每个孔加入梯度浓度样本100ul，做复孔，室温2小时孵育；

步骤2、用PBS-T洗涤，加连接酶HRP的抗Her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；

步骤3、用PBS-T洗涤，加酶底物TMB显色10分钟，测OD_450nm值，绘制标准曲线，待用；

步骤4、加待测血清至包被有抗Her2单克隆抗体1的载体上，室温2小时孵育；

步骤5、用PBS-T洗涤，加连接酶HRP的抗Her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；

步骤6、用PBS-T洗涤，加酶底物TMB显色10分钟，测OD_450nm值，代入到步骤3中的标准曲线，获得待测血清中Her2含量。