[发明专利]敲减人TRAC/TRBC基因的siRNA、慢病毒载体、CAR-T细胞构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种敲减人TRAC/TRBC基因的siRNA、慢病毒载体、CAR‑T细胞构建方法及应用，涉及肿瘤免疫治疗技术领域，基于依赖TCR识别某种抗原的T细胞会大量增殖并可能引起炎症等不良反应，这些CAR‑T细胞不能专一的进行肿瘤细胞的杀伤，影响整体的疗效的问题而提出的。本发明包括一种敲减人TRAC或TRBC基因的siRNA、siRNA的慢病毒表达载体、敲减TRAC或TRBC基因的CAR‑T细胞。本发明的有益效果在于：保证CAR‑T细胞能够特异性且专一地发挥肿瘤杀伤能力。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种敲减人TRAC或TRBC基因的siRNA、慢病毒载体、CAR-T细胞构建方法及应用。

背景技术

当前，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)已经成为全球针对肿瘤治疗最具前景的疗法。CAR-T技术是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(CD8、CD28)、胞内信号分子(CD3ξ)，共刺激因子(CD28、4-1BB、OX40)在体外进行基因重组，生成重组载体，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，也即CAR-T细胞，这些嵌合抗原受体修饰后的T细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，在肿瘤免疫应答中起主要作用，但是肿瘤细胞表面的MHC(主要组织相容性复合物)在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况，这样长期形成的免疫逃逸机制能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力，这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合，而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径，从而克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，打破宿主的免疫耐受。所以，它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗策略。

以嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)治疗手段在血液肿瘤的治疗上取得了重大突破，以CD19为靶点的免疫治疗，在治疗急性淋巴细胞白血病和复发和难治性大B细胞淋巴瘤适应症上，美国FDA已批准诺华的Kymriah和凯特的Yescarta细胞治疗产品上市。

TCR受体是T细胞表面特征性标志，它与CD3分子以非共价键结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的主要功能是识别细胞表面抗原，它是由两条肽链构成异二聚体，α和β两条链组成TCRαβ受体分子，γ和δ两条链组成TCRγδ受体分子，每条链都包含V区(variable，可变区)、J区(joining，连接区)和C区(constant，恒定区)，此外β肽还包含D区(diversity，变异区)。TCR基因的多样性是由多个不连续的的V、D、J、C基因片段重排和核苷酸的随机插入、剪接、二次重排等获得。90％-95％的外周血T细胞仅表达TCRαβ受体分子。T细胞对异源抗原的识别，主要涉及MHC-抗原肽-TCR三类分子间的相互作用，直接制约了免疫系统的特性，包括应答特异性、MHC等位基因特异性、TCR受体库选择的特异性等。自体的CAR-T细胞治疗，主要是通过非MHC限制的方式，scFV单链抗体结合靶细胞表面的抗原分子后，信号传递至胞内，激活信号共刺激因子并激活T细胞的扩增，导致细胞因子或杀伤因子的释放，并募集多种免疫细胞和免疫分子共同杀伤肿瘤细胞。但是，由于异体T细胞上的TCR与受体患者MHC-抗原肽分子不匹配，在利用异体CAR-T治疗肿瘤患者时，极易出现移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)，对患者本身有很大的潜在风险。