[发明专利]基于CRISPR-Cas9的基因组无痕编辑的载体与应用

说明书

本发明涉及基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与应用。一种基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，结构为同源臂、sgRNA基因、启动子pGAL、Cas9、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点六个组件顺次连接组成环形载体。本发明所构建质粒中的Cas9基因具有作为基因编辑和反向筛选标记的双重功能，因而Cas9经诱导发挥作用时，Cas9蛋白即会识别基因组上的靶向基因，也会识别载体中的同源臂基因，进而在实现靶向基因编辑的同时，亦可以将整个载体从目标菌株中进行切除，达到无痕敲除的目的。

技术领域

本发明涉及基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

酵母作为一种微生物工程菌，在生产脂肪酸等方面一直以来受到很大关注，相比较大肠杆菌，酵母中有蛋白质加工等相关系统，表达的蛋白等产物往往接近天然产物，生物活性好。热带假丝酵母作为一种非常规酵母，具有很高的合成、修饰和储存细胞内脂质的能力，具备较高的脂肪酸衍生物，如：ω-羟基脂肪酸、10-羟基-2-癸烯酸、氨基脂肪酸等生产能力或生产潜力，但一直缺乏一种高效无痕的编辑系统对其进行基因编辑，本发明提供一种适用于热带假丝酵母的高效无痕的基因组编辑系统，这无疑具有巨大的应用前景。

传统的基因编辑技术是基于人工核酸内切酶的基因编辑技术，分别是：锌指核酸酶 (Zinc-finger nucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs)，但是这两种方法程序较复杂、技术难度较大、组装时间较长、费用较高、效率不高，在很多方面上制约了这两种技术的应用。与传统的基因编辑技术相比，该编辑系统具有良好的靶向性、构建简单、效率高、可同时快速敲出多倍体中相同基因等优点，在近几年分子生物学中CRISPR-Cas9开始作为一种新的、高效率的基因编辑技术被广泛使用，仅在短短几年时间里已经在人体细胞、老鼠、斑马鱼、植物、细菌、真菌等多种生物中成功实现了对靶基因的定向编辑，目前该技术已成为基因编辑的首选技术。如中国专利文献CN105593367A(申请号CN201580000476.8)、中国专利文献CN105695485A(申请号 CN201410606474.0)、中国专利文献CN105886498A(申请号CN201510240981.1)、中国专利文献CN105647962A(申请号CN201610085619.6)、中国专利文献CN105331607A(申请号CN201510688330.9)、中国专利文献CN105567738A(申请号CN201610028603.1)、中国专利文献CN105907758A(申请号CN201610330754.2)和国外专利文献WO2017092201 (申请号WO2016CN77337)等。

CRISPR-Cas9技术是在一个长约20bp左右的sgRNA引导下、利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术已经成为现代分子生物学和生物信息学的重要组成部分，为后期的进一步方法优化和改造提供了基础，如中国专利文献 CN105907758A(申请号CN201610330754.2)则公开了一种CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法。但CRISPR-Cas9技术尚无在热带假丝酵母中进行基因编辑的报道。

目前尚有的微生物基因的无痕编辑主要通过正向筛选标记(一般为抗性基因或遗传缺陷型基因)以及反向筛选标记(果聚糖蔗糖酶编码基因sacB、毒素蛋白基因mazF)实现，这其中反向筛选标记的选择及使用极大的影响了微生物基因的无痕编辑的筛选效率，即便如此，利用现有反向筛选标记实现二次筛选仍然存在许多弊端，如需额外添加诱导物、诱导物添加的量难以控制、微生物对反向筛选标记的抗性容易积累等，往往会造成假阳性率高等问题，增加了后期筛选的难度。

发明内容