[发明专利]一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）核酸恒温扩增方法

说明书

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin‑resistant Staphylococcus aureus，MRSA)核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增耐甲氧西林金黄色球菌(MRSA)的两个特异性引物对，所述引物可以从极低MRSA拷贝数的检测样品中扩增出对应于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的两个特征性序列(SA 23s rRNA和mecA RNA)的扩增产物。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有MRSA(SA 23s rRNA和mecA RNA)的待测样品进行扩增，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及细菌的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillinresistant staphylococcus aureus，MRSA)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。

1961年Jevons在英国首次发现MRSA，60年代中期扩展到欧洲许多国家及加拿大，70年代末急剧增多遍及世界，并引起爆发流行，导致死亡率上升，医疗费用增加，成为全球性问题。20世纪90年代，世界各地有关MRSA流行的研究报道明显增加。在国外一些大型教学医院，MRSA占临床分离金葡菌的60％～80％。我国1998～1999年院内感染MRSA占金葡菌的比例超过80％，而社区感染MRSA占金葡菌的比例接近22％。各地区和医院的检出率都明显有逐年增加的趋势。几乎所有MRSA都是多重耐药，对现有的β-内酰胺类抗生素如青霉素类和头孢菌素类均不敏感，对氯霉素、氯林可霉素、氨基糖甙类、四环素和大环内酯类抗生素及喹喏酮类亦不敏感，万古霉素等糖肽类抗生素成为治疗MRSA感染的最后一道防线。

目前临床应用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法有：纸片扩散法(K-B法)、肉汤(琼脂)稀释(MIC)法、浓度梯度(E-test)法、自动化药敏检测、Real-Time PCR法等检测方法。

纸片扩散法(K-B法)是在MH琼脂加入苯唑西林，将菌液调至0.5麦氏浊度，涂沫于上述平板，35℃孵育24h，耐药抑菌图≤11mm，敏感抑菌图≥17mm。K-B法的最大优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受，但易造成漏检的情况。受培养环境中各因素影响，一些菌株的耐药性得不到完全表达有关。

肉汤(琼脂)稀释(MIC)法是用MH肉汤(或琼脂)培养液加NaCl至20g/L浓度，同时加入一定量的Ca、Mg离子，将苯唑西林进行倍比稀释约为0.125～16μg/ml，菌浓度为10⁴个/mL，35℃孵育24h，MIC＜2μg/mL即为敏感，＞4μg/mL即为耐药，该法检出率可达95％，重复性好，但操作较说明书繁琐。

浓度梯度(E-test)法是在含20g/L NaCl的MH琼脂平板上，贴上苯唑西林的试条，菌液调至0.5～1麦氏浊度，35℃孵育24h，直接读取MIC值。MIC值＞4μg/mL为耐药，在MIC＜2μg/mL为敏感。E-test法在检测低水平或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确。具有精确、可靠、稳定性好的特点，但价格昂贵。