[发明专利]一种鸭瘟活疫苗及其制备方法

说明书

本发明提供了一种鸭瘟活疫苗及其制备方法，属于生物制品制备技术领域。本发明利用鸡胚成纤维细胞系DF‑1作为鸭瘟病毒宿主生产鸭瘟病毒液，再向制得的病毒液中加入耐热保护剂制备成鸭瘟病毒活疫苗。本发明采用DF‑1来培养鸭瘟病毒，避免了CEF细胞培养病毒存在外源病毒污染的安全隐患，由于DF‑1细胞随用随取，省时省力，极大地降低了鸭瘟病毒培养过程中的生产成本，制得的鸭瘟活疫苗安全性好、免疫效力高、对鸭瘟的强毒攻击具有完全的免疫保护作用，疫苗中添加了改良耐热保护剂，使得鸭瘟活疫苗可在2‑8℃保存24个月，病毒含量和效价不降低，从而降低了保存要求，便于鸭瘟活疫苗的储存和运输，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术领域，具体地涉及一种鸭瘟活疫苗及其制备方法。

背景技术

鸭瘟（Duck Plague，DP），是由鸭瘟病毒（Duck Plague Virus，DPV）引起的鸭、鹅及多种雁目禽类的一种急性败血性传染病。DPV传播迅速，流行广泛，发病率和死亡率非常高，给养鸭业造成巨大的经济损失，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。免疫接种鸭瘟病毒疫苗是防制鸭瘟的有效措施之一，生产鸭瘟病毒疫苗需要培养大量的鸭瘟病毒液。我国目前繁殖鸭瘟病毒所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞（CEF）。虽然国家已规定所使用的鸡胚必须来源于SPF鸡群，但是由于检测的滞后性及饲养环境的复杂性，使得生产鸭瘟用CEF细胞存在外源病毒污染的安全隐患；另外，生产时要用大量鸡胚，劳动强度大，同时也加大了CEF细胞被污染的可能性。目前已有报道表明鸡肝癌细胞系可作为鸭瘟病毒的宿主细胞，但是鸡肝癌细胞极不易培养，增加了鸭瘟病毒培养的生产成本。

DF-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，来源于ELL鸡胚胎，该细胞在形态上呈纤维状。DF-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已有研究表明传染性法式囊病毒、鸡马立克氏病毒、新城疫病毒均能在DF-1细胞上生长良好，但是没有DF-1细胞系培养鸭瘟病毒方法的报道。

现有技术中鸭瘟活疫苗的保存方法是-15℃以下保存24个月，该疫苗从生产、检验到出厂，再从经销商到用户至少需经2个月的时间，此间一旦储存温度超过-15℃这个“冷链”，就会造成疫苗中活病毒含量下降，影响疫苗的使用效果，甚至造成免疫失败。同时这种保存条件在一定程度上增加了保存成本，不利用运输和储存。若能提供一种保存条件温和的鸭瘟活疫苗，则有利于降低疫苗的保存成本，减少因保存条件改变所带来的疫苗品质的下降。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种无外源病毒污染、操作简便、成本低、保存条件温和的鸭瘟活疫苗及其制备方法。

本发明提供的鸭瘟活疫苗中的鸭瘟病毒是以鸡胚成纤维细胞系DF-1为宿主培养得到的。

所述鸭瘟活疫苗通过以下步骤制备得到：

（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

（2）接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；

（3）收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-5%的体积比接种于DF-1细胞，培养，收获鸭瘟病毒液，鸭瘟病毒液中病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀/ml；

（4）病毒液中加入耐热保护剂，冻干制得鸭瘟病毒活疫苗。

步骤（1）所述超剂量为不低于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。

步骤（1）所述DF-1细胞液中添加9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。

步骤（1）所述DF-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。