[发明专利]一种鸭瘟活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种鸭瘟活疫苗，其特征在于，所述鸭瘟活疫苗中的鸭瘟病毒是以鸡胚成纤维细胞系DF-1为宿主培养得到的，所述鸭瘟活疫苗通过以下步骤制备得到：

(1)超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

其中，步骤(1)中向所述DF-1细胞液中添加体积比3％-8％的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液；

其中，步骤(1)所述超剂量为10^6.5-10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3％-12％接种量；

(2)接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤(1)再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内CPE达75％以上时收获病毒液；

(3)收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5％-5％的体积比接种于DF-1细胞，培养，收获鸭瘟病毒液，鸭瘟病毒液中病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀/ml；其中，步骤(3)所述DF-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液；

(4)病毒液中加入耐热保护剂，冻干制得鸭瘟病毒活疫苗；所述耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶1％～4％，蔗糖5％～15％或海藻糖1％～5％，山梨醇2％～4％或甘露醇2％～3％，胰蛋白胨1％～4％或脱脂奶2％～5％，L-谷氨酸钠0.005％～0.1％或精氨酸1.5％～3％，溶剂为PBS溶液；所述％为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。

2.如权利要求1所述的鸭瘟活疫苗，其特征在于，步骤(4)所得鸭瘟活疫苗每羽份疫苗中病毒含量不低于10^3.5TCID₅₀。

3.根据权利要求1所述的鸭瘟活疫苗，其特征在于，步骤(2)中，接毒后6-9日收获细胞液。

4.根据权利要求1所述的鸭瘟活疫苗，其特征在于，步骤(1)所述超剂量为10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3-8％接种量。

5.根据权利要求1所述的鸭瘟活疫苗，其特征在于，步骤(1)-(3)中所用的DF-1细胞培养液含90％～92％体积百分比的DMEM/F12液、抗生素和8％～10％体积百分比的牛血清，细胞培养液的pH值为7.0～7.2。

6.根据权利要求1-5任一所述的鸭瘟活疫苗，其特征在于，步骤(4)所述耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶2％～4％，蔗糖9％～12％或海藻糖2.5％～5％，山梨醇2.5％～4％或甘露醇2％～3％，胰蛋白胨2％～4％或脱脂奶2％～5％，L-谷氨酸钠0.008％～0.03％或精氨酸1.5％～3％，溶剂为0.01-0.02M的PBS溶液。

7.一种鸭瘟活疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸭瘟活疫苗中的鸭瘟病毒是以鸡胚成纤维细胞系DF-1为宿主培养得到的；所述鸭瘟活疫苗通过以下步骤制备得到：

(1)超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

其中，步骤(1)中且向所述DF-1细胞液中添加体积比3％-8％的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液；

其中，步骤(1)所述超剂量为不低于10^6.5-10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3％-12％接种量；

(2)接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤(1)再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内CPE达75％以上时收获病毒液；

(3)收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5％-5％的体积比接种于DF-1细胞，培养，收获鸭瘟病毒液，鸭瘟病毒液中病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀/ml；其中，步骤(3)所述DF-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液；

(4)病毒液中加入耐热保护剂，冻干制得鸭瘟病毒活疫苗；所述耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶1％～4％，蔗糖5％～15％或海藻糖1％～5％，山梨醇2％～4％或甘露醇2％～3％，胰蛋白胨1％～4％或脱脂奶2％～5％，L-谷氨酸钠0.005％～0.1％或精氨酸1.5％～3％，溶剂为PBS溶液；所述％为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。