[发明专利]脂质体复合物及其应用和降低鲭鱼鱼露中生物胺含量的方法

权利要求书

1.一种脂质体复合物，其特征在于，所述脂质体复合物采用以下方法制得：

(1)根据鲭鱼鱼露中主要产胺菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae ATCC 13047产胺相关基因luxR序列设计并合成siRNA分子si-luxR，luxR序列如SEQ NO:1所示；

(2)以si-luxR为包封物，与空白阳离子脂质体形成脂质体复合物L-ecl-si-luxR，步骤(1)中所述si-luxR为双链，其序列为：

正义链：5'-UUAACACGUCUAUUUGUCGCG-3'；

反义链：5'-CGACAAAUAGACGUGUUAAAU-3'。

2.根据权利要求1中所述的脂质体复合物，其特征在于，所述空白阳离子脂质体的制备方法为：取大豆磷脂，N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶解于溶剂中，旋转蒸发成膜得到薄脂质膜；将薄脂质膜在葡萄糖溶液中水合，得到脂质体混合液。

3.根据权利要求2中所述的脂质体复合物，其特征在于，所述空白阳离子脂质体由以下质量百分数的成分组成：N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵20～40％；大豆磷脂25～40％；胆固醇25～40％；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 5～20％。

4.根据权利要求1中所述的脂质体复合物，其特征在于，步骤(2)中所述的脂质体复合物L-ecl-si-luxR的粒径为200-300nm。

5.根据权利要求1中所述的脂质体复合物，其特征在于，步骤(2)中所述的脂质体复合物L-ecl-si-luxR包封率大于或等于75％。

6.根据权利要求1中所述的脂质体复合物，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)根据鲭鱼鱼露中主要产胺菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae ATCC 13047的产胺相关基因luxR设计并合成干扰luxR基因的分子si-luxR；

si-luxR为双链，其序列为：

正义链：5'-UUAACACGUCUAUUUGUCGCG-3'；

反义链：5'-CGACAAAUAGACGUGUUAAAU-3'；

T7启动子模板DNA为5'-TAATACGACTCACTATAGGAGACAGG-3'；

(2)体外转录法合成si-luxR：取siRNA分子正义链和T7启动子引物模板混合，90～100℃预变性2～5分钟，冰浴15～30分钟，再加入10xKlenow缓冲液，三磷酸脱氧核苷，双蒸水,Klenow酶，30℃～40℃水浴20～40分钟；取反应液，加入缓冲液，三磷酸核苷混合物，双蒸水和T7 RNA聚合酶，30～40℃水浴1～4h；相同的方法制备反义链DNA产物，将两种DNA转录产物混合，30～40℃下水浴16～24个小时，通过转录试剂盒的方法消化DNA模板，并纯化siRNA分子，备用；

(3)空白阳离子脂质体的制备：称取大豆磷脂，N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，溶解于氯仿-甲醇,旋转蒸发成膜；将薄脂质膜在5％葡萄糖溶液中水合，随后振荡并将所得脂质体通过100nm聚碳酸酯膜过滤器挤出8～12次，得到粒径大小在100nm左右的脂质体混合液，获得阳离子脂质体溶液；

(4)脂质体复合物L-ecl-si-luxR制备：将si-luxR与空白阳离子脂质体分别溶于1％焦碳酸二乙酯水中，混匀混合静置过夜；阳离子脂质体所带的总正电荷与si-luxR所带的总负电荷之比为1:1～10:1；涡旋处理5～10min，室温下孵育15～20min，形成脂质体复合物L-ecl-si-luxR，冷冻干燥备用。

7.如权利要求1-6任意一项所述的脂质体复合物的应用，其特征在于，所述脂质体复合物加入至鲭鱼鱼露中，降低鲭鱼鱼露中的生物胺含量。