[发明专利]一种转基因阳性组织的筛选方法

说明书

本申请公开了一种转基因阳性组织的筛选方法将引入Kpn I和Xba I酶切位点的启动子连接到第三步已经连接上DsRED基因的双元载体上；将含有所述启动子和DsRED基因的双元载体的融合质粒导入到农杆菌中，形成可以用于介导转化植物细胞的工程菌；利用上述工程菌转化水稻的愈伤组织。本发明方法可以在植物转基因初期可以观察到转基因是否成功的一种快捷的报告基因检测方法，为后续的高效率的阳性植株筛选提供了依据。

技术领域

本发明涉及基因工程遗传育种学和生物遗传改良技术领域，特别涉及一种转基因阳性组织的筛选方法。

背景技术

水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一.在过去的半个多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功.水稻的单位产量实现了倍增，部分地方甚至提高至3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献.但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重.然而，世界人口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。

针对这些问题，我国学者提出了培育绿色超级稻的设想，围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状，对水稻品种进行全面改良以实现农业的可持续发展.而转基因技术作为一种新兴的育种手段，在实现绿色超级稻目标上将发挥重要作用.

水稻的转基因研究始于20世纪80年代末期，迄今已有大量的转基因水稻研究被报道。

水稻转基因技术始于原生质体培养，1985年首次成功地从水稻原生质体再生完整植株；1988年在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株；1990年从籼稻品种ChinsurahBoro II中获得第一例转基因籼稻植株；1990年李宝健等用农杆菌感染水稻组织获得转化愈伤组织；1991年利用水稻幼胚作为受体材料，用基因枪法，成功获得转基因植株，并且转化效率明显提高。

从此，幼胚作为转基因受体材料得到广泛研究应用。1993年用农杆菌法在粳稻品种上获得了转基因植株，此后，基因枪轰击法和农杆菌介导法作为最有价值的转化途径广泛用于水稻转基因研究。

利用转基因方法获得的转基因植株及其产生的后代，怎么证明外源基因已转入受体，或稳定遗传。主要分以下几个层次鉴定：1).外源基因整合的鉴定，主要有Southern杂交和PCR法检测阳性。2).外源基因转录水平的鉴定，有Northern杂交和RT-PCR(reversetranscribed PCR)检测法。3).外源基因表达蛋白的检测，主要有三种：①生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；②免疫学检测法：通过目的蛋白(抗原)与其抗体的特异性结合进行检测，如Western杂交；③生物学活性的检测。4).报告基因的酶法检测，常用的报告基因有：gus、nos、ocs等。

当然最后转基因植株必须移栽于大田，进行田间鉴定，不仅对改良性状还要对其它农艺性状进行评价，选育综合性状优良的株系。这样会花费大量的财力和人力，而且会花费较长的时间。

CaMV35S启动子是指来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。这种启动子在植株被CaMV感染期间，指导35S RNA合成，并且使之在许多双子叶植物的组织中高效表达，但它是单子叶植物的一种较弱的启动子。CaMV35S启动子作为一种组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也相对恒定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，本发明提供了一种基于DsRED荧光蛋白基因为报告基因的工程菌株的改造，本发明方法可以在植物转基因初期可以观察到转基因是否成功的一种快捷的报告基因检测方法，为后续的高效率的阳性植株筛选提供了依据。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种转基因阳性组织的筛选方法，包括以下步骤：