[发明专利]一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA及其检测方法

说明书

本发明公开了一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA，从而检测其突变情况，用于肿瘤的突变检测。目前常规的基因检测通过PCR技术实现，但现有的PCR技术存在一些缺陷如灵敏度不高、特异性不强、目的片段常采用DNA等，相比之下本发明模板可以是DNA也可是RNA，检测结果可通过荧光读数直观判断人EGFR基因外显子21L858是否发生突变，而无需高通量测序，具有成本低、可多次重复检测、检测速度快，结果可直观分析等优势，适用于大规模的临床样本检测。

技术领域

本发明公开了一种基于CRISPR-Cas13a系统检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA及其应用。

背景技术

EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21～24编码C-Lobe。迄今为止发现的，迄今为止的资料证明EGFR突变主要位于外显子19至外显子21，EGFR突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。EGFR外显子突变的检测，可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。因此检测人EGFR基因突变有利于肿瘤的预防与治疗。

然而目前，医院和检测机构常用的核酸检测技术是基于PCR(聚合酶链式反应)技术发展而来的，但现有的PCR技术存在一些缺陷如灵敏度不高、特异性不强等，而且无法应用到大规模的临床样本研究，因此，亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。基于此本项目研究了一种通过利用CRISPR-Cas13a技术，Cas13a仅靶向crRNA指定的RNA，并以一种非特异性的方式切割单链靶RNA的原理，旨在设计与人EGFR基因外显子21L858突变靶点相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR-Cas13a系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、检测速度快，结果可直观分析等优势，可适用于临床样本，这对大规模的临床样本检测具有重大意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于CRISPR技术中中特异性靶向EGFR基因外显子21L858突变的crRNA，本发明还提供一种靶向EGFR基因外显子21L858突变的检测方法。

本发明技术方案如下。

一种基于CRISPR技术检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA，包括CRISPR-Cas13a系统，还包括可与CRISPR-Cas13a系统结合的crRNA，所述crRNA序列格式为5`-Cas13a蛋白锚定序列-crRNA向导序列-3`。

所述Cas13a蛋白为Lw Cas13a时，所述crRNA序列中的锚定序列为

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC，所述crRNA序列如SEQ NO：1所示

SEQ1

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAGCCCAAAAUCUGUGAUCUUG

所述的crRNA转录模板DNA序列如SEQ NO：2所示

SEQ2

CAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC。