[发明专利]一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA及其检测方法在审
| 申请号： | 201810719181.1 | 申请日： | 2018-07-03 |
| 公开（公告）号： | CN108841958A | 公开（公告）日： | 2018-11-20 |
| 发明（设计）人： | 程诚 | 申请（专利权）人： | 武汉博杰生物医学科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12N15/11 |
| 代理公司： | 武汉明正专利代理事务所(普通合伙) 42241 | 代理人： | 江沣 |
| 地址： | 430105 湖北省武汉市东湖高新*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 突变 外显子 检测 种检测 高通量测序 多次重复 基因检测 检测结果 临床样本 目的片段 突变检测 荧光读数 直观分析 常规的 灵敏度 直观 肿瘤 | ||
1.一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA，其特征在于：包括CRISPR-Cas13a系统，还包括可与CRISPR-Cas13a系统结合的crRNA，所述crRNA序列格式为5`-Cas13a蛋白锚定序列-crRNA向导序列-3`。
2.根据权利要求1所述一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA，其特征在于：所述Cas13a蛋白为Lw Cas13a，所述crRNA序列中的锚定序列为
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC，所述crRNA序列如SEQ NO：1所示
SEQ1
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAGCCCAAAAUCUGUGAUCUUG
所述的crRNA转录模板DNA序列如SEQ NO：2所示
SEQ2
CAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC。
3.根据权利要求2所述一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA，其特征在于：所述Cas13a蛋白为Lsh Cas13a，所述crRNA序列中的锚定序列为
CCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAAC，所述crRNA序列如SEQ NO：3所示
SEQ3
CCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAACGCCAGCCCAAAAUCUGUGAUCUUG
所述的crRNA转录模板DNA序列如SEQ NO：4所示
SEQ4
CAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCGTTTTAGTCCCCTTCGATATTGGGGTGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的一种检测外显子21L858突变的方法，其步骤包括，1)首先制备样本靶标crRNA，具体序列如权利要求2～3所述，将合成的crRNA反转录成DNA并在5`添加T7启动子序列，将上述带T7启动子DNA在T7RNA聚合酶作用下生成足量的crRNA；2)然后将Cas13a蛋白、crRNA、RNAreporter、RNA酶抑制剂和样本RNA在核酸酶缓冲液中孵育，所述的样本RNA为EGFR基因外显子21L858目标RNA；3)通过荧光读数分析EGFR基因外显子21L858所表达的RNA靶序列的数量。
5.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的一种检测EGFR基因外显子21L858突变的方法，其特征在于：步骤1)所制备的靶标crRNA为化学合成的crRNA。
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