[发明专利]一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法

说明书

本发明公开了一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法，属于鱼胶原蛋白提取纯化技术领域。该方法是将冻干鱼皮剪碎后加入氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液的混合溶液，搅拌后离心；向沉淀中加入异丙醇溶液，搅拌后离心；向沉淀中加入盐酸胍溶液，搅拌离心；向沉淀中加入乙酸溶液，再加入胃蛋白酶，搅拌后离心；向上清液中边搅拌边滴加入氯化钠‑乙酸母液，搅拌后离心；向沉淀中加入乙酸溶液溶解沉淀后透析；透析后将透析袋内的沉淀溶解于乙酸溶液中，加到正压过滤设备，用微孔滤膜过滤上清得蛋白溶液；先用乙酸溶液透析，再用水透析，得到胶原凝胶，冻干后即得胶原蛋白。获得的蛋白产物结构完整，生物活性保持完好，可直接用于医用及组织工程材料。

技术领域

本发明涉及一种高质量可放大型鱼胶原蛋白提取纯化方法，属于鱼胶原蛋白提取纯化技术领域。

背景技术

胶原蛋白是广泛存在于皮肤、血管、骨骼与脑膜等多种结缔组织中的结构蛋白质，在动物的生长、发育以及结构的维持、稳定与保护过程中发挥着重要的作用。在前期的研究中也发现，作为细胞基质中的主要成分，胶原蛋白的存在可以为创口处的细胞提供贴附场所，并能够辅助多种生长因子作用于细胞，从而促进细胞的分裂与分化，进而促进创口的再生；同时，胶原蛋白材料之内的纤维与空隙结构可以使血小板细胞贴附、聚集，从而促进血栓的形成并显著的加速血液凝固，起到了很好的止血效果；另一方面，胶原蛋白可以抑制创口处部分负责降解细胞外基质的蛋白酶活性，本身的降解物也可以直接作用于创口处，为组织的再生提供氨基酸补给，从而促进创口处胞外基质的生成与稳定。因此，胶原蛋白的这些功能特性赋予了它在医用材料、组织工程方面优异的应用前景。

我国具有广阔的海岸线，因此具有丰富的水产资源。然而在加工鱼类产品时，鱼皮、鱼骨等鱼结缔组织会被直接丢弃。而这些组织中含有丰富的胶原蛋白。利用这些鱼类结缔组织作为胶原蛋白的来源，可以有效的降低成本，并对于绿色海洋经济起到良好的促进作用。

正常具有生物活性的三螺旋胶原蛋白是一种酸溶性蛋白，单链分子量在120kD左右在中性条件下会通过胶原蛋白之间的聚合及自组装形成较大的蛋白结构，继而可通过自然/化学/物理交联形成胶原蛋白材料，包括胶原凝胶及胶原海绵等。在这个过程中，胶原蛋白的结构、质量会直接影响到后续胶原材料的质量和强度。因此，可用于组织工程及医用材料的胶原蛋白不仅对于胶原蛋白本身的纯度要求较高，同时对于胶原蛋白的原始结构及蛋白完整性有着较高的要求。在一般的实验文献所述的方法中，胶原蛋白的纯化一般是通过氢氧化钠洗涤去除部分杂蛋白，再通过醇类洗涤去除脂类，继而在酸性条件下通过蛋白酶解获得胶原蛋白溶液，利用氯化钠盐析获得目的胶原蛋白。这样的方法获得的胶原蛋白生物活性得到保留，可以满足蛋白分析以及实验的要求，但纯度无法满足体内植入的要求，仍包含部分杂蛋白与杂质，体内植入后易引起排异反应。同时，该纯化方法的固液分离极度依赖离心设备，这意味着这种方法只能在实验室进行小规模的纯化，成本较高，无法进行放大生产。同时在这类方法中，胃蛋白酶的活性没有及时终止，这也容易造成蛋白的过渡消化，包括了提取率的降低及蛋白活性下降等。

现阶段的胶原蛋白纯化技术主要围绕小分子胶原蛋白的提取，如在CN103993061A、CN104672323A、CN201710309865等专利中提到的纯化技术。这一类分离、纯化得到的胶原蛋白分子量一般在300-5000D之间，可溶于水，蛋白产物可以达到较高的纯度。但这一类胶原蛋白由于失去了原始的结构，无法用于组织工程材料的制备，其蛋白产物一般被应用于美容、保健等方面。同时色谱柱体系的应用会显著性的限制相关方法的应用，其纯化方法难以进行扩大化，纯化成本也会显著提升。

在一些专利及文献报道中，利用有机试剂沉淀(包括乙醇、丙酮等)等方法得到了纯度较高的胶原蛋白。但在实际操作中，在最终的分离阶段使用有机试剂易于造成蛋白质的变性，使目的产物失去生物活性，同时有机试剂容易残留在终产物中，从而造成安全隐患。