[发明专利]一种界面自组装羰基还原酶及在(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯合成中的应用

权利要求书

1.一种界面自组装羰基还原酶在不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯中的应用，其特征在于所述界面自组装羰基还原酶按如下方法制备：将羰基还原酶加入pH6.0~9.0、0.05 M 的Tirs-HCl缓冲液中，再加入聚苯乙烯的甲苯溶液，在黑暗、40~100 r/min、20~40 ℃条件下，于摇床中震荡反应1~4小时，离心，获得上层为有机相、中间层为界面自组装羰基还原酶、下层为水相的反应体系，取出中间层用甲苯和pH6.0~9.0、0.05 M的Tris-HCl缓冲液分别洗涤3~5次，获得界面自组装羰基还原酶；所述羰基还原酶来自热带假丝酵母（Candida tropicalis）zjutss412，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号CGMCC No. 15016，保藏日期2017年12月4 日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述羰基还原酶加入量以缓冲液体积计为20~200U/ml，所述聚苯乙烯的甲苯溶液浓度为1.0~4.0g/L，所述聚苯乙烯的甲苯溶液与缓冲液体积比为1-3:1。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述羰基还原酶按如下方法制备：（1）将热带假丝酵母（Candida tropicalis）CGMCC No.15016经发酵培养获得的湿菌体分散于0.05 M、pH 7.9Tris-HCl缓冲溶液中，置于0～4 ℃冰水浴中，在功率405 W条件下进行超声破碎，工作2 s，间歇4 s，超声破胞20 min，破碎后于8000 r/min、4 ℃离心10 min，所得上清液，即粗酶液Ⅰ；（2）将酶液Ⅰ置于冰水浴中预冷至0～4 ℃，边温和地搅拌，边缓慢加入预先研磨成粉的硫酸铵，至硫酸铵饱和度为40%，待其溶解完全，继续冰浴搅拌1 h，于10000 ×g，4 ℃，离心10 min，得到的沉淀于1～2倍沉淀物体积的0.05 M、pH 7.9Tris-HCl缓冲液中复溶，得粗酶液Ⅱ；（3）将粗酶液Ⅱ置于10 kD Millipore超滤离心管中，于3500 ×g，4 ℃条件下，离心20 min，套管中的浓缩液即为羰基还原酶酶液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：1）将热带假丝酵母CGMCC No.15016接种到斜面培养基中，于30 ℃培养3-5 天，获得斜面菌体；斜面培养基成分：葡萄糖20 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，氯化钠1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，琼脂20 g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；2）将斜面上的菌体接种入装液25 mL种子培养基的100 mL三角瓶中，30 ℃，120 r/min培养24 h，获得种子液；种子培养基组成：葡萄糖46 g/L，酵母汁25 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，氯化钠0.1 g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；3）将培养24 h的种子液，以体积浓度10%的接种量接入装液250mL发酵培养基的1000 mL三角瓶中，30 ℃，120 r/min培养24 h，将获得的发酵液于8000 r/min的离心机中离心20分钟，弃去上清液，获得湿菌体；发酵培养基组成：葡萄糖46 g/L，酵母汁25 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，氯化钠0.1 g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以界面自组装羰基还原酶为催化剂，以3-羰基-3-苯基丙酸乙酯为底物，以NADH为辅酶，以乙醇为辅助底物，加入乙醇脱氢酶用于辅酶NADH的原位再生，以pH3.0~8.0的Tris-HCl缓冲液与甲苯形成的Tris-HCl/甲苯两相体系为反应介质，在20~40 ℃、80- 120 r/min的摇床中反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得所述的(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯。