[发明专利]一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光定量PCR扩增的上游引物、下游引物和逆转录引物，所述逆转录引物中与HBV pgRNA Poly A尾进行特异逆转录部分包含15‑22个T。本发明HBV pgRNA检测试剂盒灵敏度高和特异性检测效果好。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)。HBV DNA长链为负链，位置和长度相对固定。短链为正链，其长度可变，约为负链的50％～80％。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，世界卫生组织报告全球约有20亿人感染过HBV，其中3-4亿人为慢性HBV感染。在我国肝硬化和肝癌患者中，由HBV感染引起的比例分别高达60％和80％以上。现有的治疗药物主要为核苷酸类似物，虽然能够有效抑制病毒，但是存在长期用药、病毒耐药、病毒载量反弹等问题。对于慢性HBV感染患者，何时能够安全停药一直是困扰患者的一个问题，因此了解HBV感染肝细胞的机制能够有助于我们找到上述问题的原因。

通过研究者们对慢性HBV感染患者体内HBV复制机制的不断探索，目前更全面的HBV感染复制周期如下：HBV病毒颗粒通过与肝细胞表面受体结合，进入细胞，病毒DNA进入宿主细胞核后，在DNA聚合酶的作用下，形成共价闭合环状的cccDNA，以cccDNA为模板，转录形成3.5kb长的pgRNA。然后病毒DNA聚合酶启动逆转录过程，以pgRNA为模板，合成出病毒DNA，即rcDNA，合成的rcDNA一部分以Dane颗粒的形式释放到细胞外，另一部分直接返回细胞核内补充cccDNA池；但小部分核衣壳内的pgRNA未启动逆转录，直接获得外包膜，以pgRNA病毒样颗粒的形式释放到细胞外，进入血液系统。

根据HBV的复制感染机制，目前的停药指标主要有三种。一是血清HBV DNA低于检测下限作为停药的治疗终点，但研究发现该指标并不能客观反映cccDNA的转录活跃状态，有很大的病毒学反弹和疾病复发风险；二是临床上以血清HBV表面抗原(HBsAg)转阴作为临床治愈的指标，结果也不尽如人意，因为除了完整的Dane颗粒，HBsAg还有另外两种存在形式，数量远超Dane颗粒，且随着HBV病毒核酸长期存在于肝细胞内，HBV核酸片段能够整合到宿主基因组中，也能转录翻译产生HBsAg，会使多数慢乙肝患者面临着终生用药。三是cccDNA的清除，这是最理想的停药指标，但由于cccDNA存在于感染的肝细胞内，只能通过肝组织活检来判断病毒的清除和安全停药，这在临床实践中并不适用。

随着研究者对HBV感染复制机制更全面的认识，血清HBV pgRNA的水平就成了反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录活性状态的最好指标。当血清中检测不到HBV pgRNA时，提示患者肝细胞内cccDNA的消失或者转录静默，预示着可以安全停药。

发明内容

在一种实施方式中，本发明提供一种HBV pgRNA荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光定量PCR扩增的上游引物、下游引物和逆转录引物，所述逆转录引物中与HBVpgRNA Poly A尾进行特异逆转录部分包含15-22个T。

在一种实施方式中，所述逆转录引物的Poly A与HBV pgRNA序列连接处设计有与靶标特异结合的兼并碱基GW。

在一种实施方式中，所述逆转录引物的序列依次包括HBV pgRNA荧光定量PCR的下游引物序列、15-22个T和兼并碱基GW。

在一种实施方式中，所述上游引物是针对不同基因型HBV高度保守的序列，确保不会因为HBV序列型别差异导致漏检或检测灵敏度低；所述下游引物是不同基因型HBV高度不保守的序列，以避免HBV DNA序列的干扰。