[发明专利]红景天苷单克隆抗体的制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种红景天苷单克隆抗体制备方法及基于该单克隆抗体的应用，主要步骤为：完全抗原的制备、动物免疫与效价测定、免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的制备和融合、杂交瘤细胞的筛选及亚克隆、单克隆抗体的大量制备。制备出的抗体是一种能与红景天苷分子发生特异性免疫反应的蛋白质，利用该抗体与红景天苷的高度特异性反应建立红景天苷的间接竞争酶联免疫法，并应用于红景天药材及其中成药、保健品中红景天苷的含量检测，经过优化的间接竞争ELISA检测法操作简便、反应快速，能同时批量测定样品，在红景天中成药、保健品生产的质量控制、药学和药理学等研究工作中具有较广的实际用途。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种红景天苷单克隆抗体制备方法与应用。

背景技术

红景天（Rhodiola）是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodida)植物, 主要有效成分是红景天苷(salidroside)。红景天苷具有抗心肌缺血、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤等多种药理作用。红景天被用于多种中成药、保健品及化妆品中。测定红景天苷的方法已有一些报道，气相色谱法和薄层色谱法较少，最为常用的方法为高效液相色谱法。但这些传统检测方法依赖昂贵的精密仪器、检测成本高、前处理复杂、耗时长难以适应产品的快速检测的要求。尤其是在快速、大量检测中药有效成分,研究中药材、中药复方和中成药的有效成分含量、体内代谢过程等方面。

以单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附法(ELISA)检测方法具有快速、高灵敏、重复性好、前处理简单等特点，能够克服传统方法的缺点，有其独特的技术优势，可以在红景天药材的质量控制和评价，以及以红景天为主要成分的中成药、保健品中的检测分析、真伪鉴别、生产工艺过程质控等方面发挥重要作用。

发明内容

本发明旨在提供一种红景天苷单克隆抗体的制备方法与应用。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明所述的红景天苷单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）完全抗原的制备：将红景天半抗原分别与牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联得到免疫抗原和包被抗原；

准确称取两份红景天苷10mg于三角瓶内，分别加入20%甲醇10 mL，超声溶解；称取两份高碘酸钠5mg，加水1mL溶解，将两份高碘酸钠溶液分别加入到红景天苷溶液中，加入磁力搅拌转子，避光、室温搅拌1h，制的两份相同的红景天苷溶液；准确称取BSA、 OVA各20 mg，分别溶于2mL 0.05mol/LCBS溶液，调节pH 至9.6，完全溶解后，分别逐滴加入到两份红景天苷溶液中，匀速避光搅拌12h；剪下的透析袋pH 9.6 0.05mol/L CBS溶液预处理，将搅拌后的两种混合液转移透析袋中，透析72h，中间每间隔6h换1次透析液，获得红景天苷-BSA和红景天苷-OVA两种抗原；将经过透析处理后的两种抗原小量分装于1.5ml离心管中，-20℃冻存备用，避免反复冻融；

（2）动物免疫：取健康的6～8周雌性Balb/c小鼠，以红景天苷-BSA作为免疫原，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为100μg；之后每两周颈背部皮下多点注射一次加强免疫，采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；第四次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射，注射剂量为100μg；通过间接ELISA检测血清效价；