[发明专利]测定生物样本中特异位点DNA甲基化水平的方法及其应用

说明书

本发明公开一种测定生物样本中特异位点DNA甲基化水平的方法及其应用。该方法包括步骤：获取生物样本，并提取生物样本中的待测DNA片段；修饰待测DNA片段，将待测DNA片段中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶；以修饰后的DNA片段为模板DNA片段，以第一引物和第二引物分别从模板DNA片段两侧对模板DNA片段进行PCR扩增；处理经过PCR扩增后的PCR产物，去除多余的第一引物、第二引物和dNTPs，并纯化回收；检测待测DNA片段CpG位点的甲基化和去甲基化荧光偏振值；根据待测DNA片段CpG位点的甲基化和去甲基化荧光偏振值计算待测DNA片段的甲基化水平。实施本发明，具有简便、快捷、高通量、低成本、无需分离纯化等优点，适合大量检测临床珍贵的低浓度DNA样本的甲基化。

技术领域

本发明涉及疾病早期检测技术领域，尤其涉及一种测定生物样本中特异位点DNA甲基化水平的方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，在哺乳动物基因组中主要表现为5-甲基胞嘧啶(5mC,5-methyl-cytosine)，且多发生在两个相邻的胞嘧啶(Cytosine，C)和鸟嘌呤(Guanine，G)二核苷酸(CpG)的C上。哺乳动物基因组中60％～90％的CpG都被甲基化，很多个CpG成簇的组成CpG岛，多位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，通过甲基化水平的变化，参与基因的表达调控。近年来的研究发现DNA甲基化的异常与很多诸如肿瘤、精神疾病等重大疾病存在相关，一些基因CpG位点的甲基化程度高低可能已成为这些疾病发生的潜在标志物。快速检测这些与疾病相关基因的CpG位点的甲基化状态，对于及时发现和治疗这些疾病非常重要。

目前针对基因特异CpG位点甲基化检测多数是基于亚硫酸氢钠转换和PCR扩增基础上进行的。基因组DNA经亚硫酸氢纳处理后，甲基化的C保持不变，而非甲基化的C转换尿嘧啶(Uracil，U)并经PCR扩增后变成T。这样对于不完全甲基化的CpG位点C位置就变成了C/T的混合，对C的定量就可反映该CpG位点的甲基化水平。目前常用的定量方法多数是基于甲基化特异引物的单核苷酸延伸标记(Ms-SnuPE)，然后再依据不同的标记进行分离和定量，虽然可以测定多个位点的甲基化，但是操作复杂，需要较昂贵的仪器和设备，成本也较高；基于限制性内切酶方法或者基于同位素标记法需通过DNA胶分离，然后进行定量，虽然成本相对较低，但需要复杂的分离或转移步骤，造成定量结果偏差较大，亦或涉及放射性标记；基于生物素标记或荧光标记能量转移(FRET)等检测方法，虽然增加了灵敏度，但是需要标记、纯化和分离等步骤，增加了操作的复杂性；基于荧光探针的实时定量PCR技术，虽然提高了检测的灵敏度，但是由于探针长度和特异性的要求高，不能检测所有位点。现有方法存在的不足，限制了其在临床和科研领域的广泛应用。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种简便、快速测定特异位点CpG甲基化的方法，旨在解决现有技术操作复杂，不方便在临床和科研领域的广泛应用的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种测定生物样本中特异位点DNA甲基化水平的方法，该方法包括如下步骤：

获取生物样本，并提取生物样本中的待测DNA片段；

采用亚硫酸氢钠修饰待测DNA片段，将待测DNA片段中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶；

以亚硫酸氢钠修饰后的DNA片段为模板DNA片段，以第一引物和第二引物分别从模板DNA片段两侧对模板DNA片段进行PCR扩增，所述第一引物和第二引物扩增的模板DNA片段包括待测DNA片段的CpG位点；

采用碱性磷酸酶处理经过PCR扩增后的PCR产物，去除多余的第一引物、第二引物和dNTPs，并纯化回收；

分别取等量纯化后的PCR产物，在两个单独的反应体系中分别进行甲基化特异第三引物引导的单碱基延伸标记反应，检测待测DNA片段CpG位点的甲基化和去甲基化荧光偏振值；