[发明专利]一种EB病毒DNA的定量检测方法

权利要求书

1.一种EB病毒DNA的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)试剂配制：

A、在试剂制备区内将试剂盒内各组分取出，室温融化后，离心数秒；

B、设所需要的的管数为n，配制反应液；

C、算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入40μL，转移至样本处理区；

(2)样本处理：

A、根据标本的不同选择不同的提取方式：血浆样本、外周血样本及咽拭子样本，选择相应的试剂盒，按照其说明书和注意事项进行提取即可，若提取好的DNA当天不使用，则要保存在-20℃；

B、取自配阴性对照、阳性对照按照外周血样本处理方法提取，取定量参考品10μL加核酸释放剂10μL混匀待用；

(3)加样：向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性质控品各10μL，盖紧PCR反应管管盖，转移至扩增区；

(4)扩增：反应管瞬时离心后放入荧光定量PCR仪上，编号并设好各工作标准参数，按一定程序进行扩增：1个循环50℃，2min；1个循环94℃，5min；然后进行45个循环94℃，15s和57℃，30s；1个循环35℃，10s；

(5)结果判断：根据检测样本中实测的拷贝数和Ct值，对检测报告进行定性和定量的确定。

2.根据权利要求1所述的检测的方法，其特征在于，在步骤(1)B中，管数n＝样本数+1管阴性对照+1管空白对照+1管高值质控品+1管低值质控品+4管阳性参考品，另由于分装的消耗需增加N/15,若N/15＜1按1计算。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在步骤(1)B中，该反应液的配制比例为PCR反应液：酶混合物：内标＝38:2:1。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)A中血浆样本的提取方法：取离心管加入浓缩液；取待测血浆样本、质控品各100μL，分别加到离心管中；振荡混匀，离心；吸弃上清，沉淀中加入核酸释放剂，振荡混匀，静置。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)A中外周血样本的提取方法：向离心管中加入1000μL红细胞裂解液，混匀外周血样本，取300μL外周血样本加入到离心管中，充分振荡混匀，静置，离心，吸弃上清；再加入950μL红细胞裂解液，充分振荡混匀，离心，吸弃上清；向离心管中加入950μL生理盐水，漩涡至透明清亮，离心，吸弃上清；向沉淀中加入核酸释放剂，将沉淀振荡混匀，静置。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(2)A中咽拭子样本的提取方法：向咽拭子样本收集管中加入1mL生理盐水，振荡混匀，将全部咽拭子样本液体倒入离心管中；吸取100μL咽拭子样本液体至0.5mL离心管中，再加入100μL浓缩液，振荡混匀，离心，吸弃上清，沉淀中加入核酸释放剂，振荡混匀，静置。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，离心。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述结果判断依据如下：

A、检测样本中2.00E+03copies/mL≤EBV DNA＜1.68E+07copies/mL，报告相应的拷贝数，检测报告定性为阳性；

B、若检测样本中EBV DNA≥1.68E+07copies/mL，需用阴性全血/血浆101倍稀释，使其拷贝数范围落在l0⁴～10⁷copies/mL范围内再重新测定，报告结果应乘以101,检测报告定性为阳性；

C、检测样本EBV DNA＜2.00E+03copies/mL或Ct值无数值时，报告为＜2.00E+03copies/mL，检测报告定性为阴性；

D、当EBV DNA≤2.00E+03copies/mL，且Ct值≤35时，需增加建议解释，定量为具体拷贝数，定性则为Ct值。

9.根据权利要求1-8所述的检测方法，其特征在于，所述结果判断中，阴性对照无Ct值显示，但内标检测为阳性。