[发明专利]一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞（NSCs）制备方法及应用。本发明构建的过表达慢病毒能安全有效地对NSCs进行三基因联合修饰，修饰后的干细胞过表达Bcl2，提升了移植后NSCs的抗凋亡及生存能力，增加有效存活干细胞数量，改善了脑梗死治疗的效果；通过FerritinH及EGFP报告基因成像，在活体水平实现对NSCs的磁共振及荧光成像双模态示踪，实现对移植后NSCs的实时、动态、无创、系统监测，为促进干细胞治疗临床转化提供实验依据，为深入阐明神经干细胞作用机制提供新的手段，在神经系统病变的干细胞替代治疗或转基因治疗方面均具有重要的科学意义和临床应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程与生物医学工程技术领域，更具体地，涉及一种 FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞制备方法及应用。

背景技术

脑梗死又称缺血性卒中，中医称之为卒中或中风。本病由各种原因所致的局 部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上 对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞 和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型，约占全部 脑梗死的60％，因而通常所说的‘脑梗死’实际上指的是脑血栓形成。本病的病 死率约为10％，致残率可达50％以上。存活者的复发率高达40％，脑梗死复发 可严重削弱患者的日常生活和社会功能，而且可明显增加死亡率。

基因工程，又称基因拼接技术和DNA重组技术，在体外将分离到的或合成 的目的基因，通过与质粒、病毒等载体重组连接，然后将其导入不含该基因的受 体细胞，使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性。基于基因工程的基 因治疗，能取代机体致病的突变基因，有目的地抑制异常基因表达或重新开启己 关闭的基因，是遗传病、肿瘤、癌症等重大疾病的一种理想的治疗模式。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-I(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展 起来的载体，它能相对定点整合到染色体的特定位置，转导的目的基因能整合至 靶细胞基因组，具有长期表达、免疫反应小等优点，在分裂和非分裂细胞中都能 高效表达，慢病毒载体安全性高，在干细胞基因工程中具有优势。

基于干细胞的细胞治疗或基因治疗是再生医学的新模式。神经干细胞 (NSCs)移植是神经系统损伤和退行性疾病的极具前景的新治疗策略。动物实 验表明NSCs移植治疗脑梗死具有确切、明显的促神经功能修复效果，但初步临 床实验中干细胞治疗效果并不确切，部分实验中患者神经功能恢复效果并不显 著。其最直接原因是移植后干细胞所处微环境诱导干细胞大量凋亡，干细胞的低 存活率限制了其再生修复能力。此外，在活体水平对移植入体内的干细胞进行示 踪，动态监测干细胞体内存活、分布、迁移及转归，是干细胞治疗临床转化的必 然需求，但是却一直未能有突破性进展。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，利用基因工程技术，成功构建FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达慢病毒，转染大鼠神经干细胞(NSCs)后获得 基因工程化干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs。FerritinH-T2A-Bcl2-EGFP过表达 慢病毒能安全、有效地对NSCs进行FerritinH、Bcl2及EGFP三基因联合修饰， 获得的基因工程化干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs不仅通过过表达Bcl2提升 了移植后NSCs的抗凋亡及生存能力，增加有效存活干细胞数量，改善治疗脑梗 死的效果；而且通过FerritinH及EGFP报告基因成像，在活体水平实现对NSCs 的磁共振及荧光成像双模态示踪，实现对移植后NSCs的实时、动态、无创、系 统监测。

本发明的第一个目的是提供一种基因修饰的可示踪神经干细胞的制备方法。

本发明的第二个目的是提供以上任一所述制备方法制备得到的基因工程化 的可示踪神经干细胞FerritinH-Bcl2-EGFP-NSCs