[发明专利]一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针

说明书

本发明公开了一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针。本发明的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13和SEQ ID NO:16～17所示；本发明的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14～15和SEQ ID NO：18所示。本发明的有益效果在于：检测时删减了突变率非常低的突变类型，在保证了其他ARMS PCR技术优点的情况下，减少了实验所需的总时间，减少了实验的成本，设计位点仍然覆盖EGFR TKI敏感突变的90％以上。另外，通过全新的设计19外显子缺失突变和L858R突变的检测引物和探针，能都得到较好的检出效率。

技术领域

本发明涉及生物技术和医学技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR TKI敏感突变的引物和探针。

背景技术

表皮生长因子受体EGFR(epidermal growth factor receptor)属于表皮生长因子受体家族(HER)，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR锚定在细胞膜上发挥生物学效应，由膜内和膜外两部分组成。膜外部分主要起到接收信号的作用，膜内部分主要通过络氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)起向下传导信号的作用。EGFR在肿瘤的发生发展中起到至关重要重要的作用，依次设计出了针对EGFR-TK的靶向抑制剂(EGFR-TK inhibitor,EGFR-TKI)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对EGFR-TKI都有反应，只有当EGFR 基因18-21外显子发生EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。19外显子缺失突变和21外显子L858R突变占所有 EGFR-TKI敏感突变的90％以上。当肿瘤细胞不携带EGFR-TKI敏感突变时，EGFR-TKI 类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测EGFR-TKI敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。

目前针对EGFR-TKI敏感突变的常见检测方法包括：Sanger测序法、ARMS PCR、数字PCR、第二代测序法等。对于Sanger测序法来说，灵明度～1％，整个实验完成需要2-3 天的时间，主要针对组织样本。目前，虽然Sanger测序法是组织EGFR-TKI敏感突变检测的金标准，但是缺点也是十分明显的，灵敏度较低，整个实验周期较长。另外对于血液样本来说，Sanger测序法比较困难。数字PCR具有高灵敏度的特点，可以达到0.1％。但是数字PCR也有较为严重的缺点，设备价格较高、稳定性不佳、对实验环境要求较高等。另外数字PCR整体上来讲，检测价格也远高于Sanger测序法和ARMS PCR。因此，目前数字PCR对于EGFR-TKI敏感突变的检测也仅仅停留在对T790M突变的检测项目上。第二代测序技术具有高通量、高灵敏性的特点，与此同时也带来了高成、高耗时、高复杂的缺点。因此，第二代测序在实际中也并不适合于EGFR-TKI敏感突变的检测。当前，最有效检测EGFR-TKI敏感突变的方法仍然是ARMS PCR。ARMS PCR全名为突变组织扩增系统PCR(amplification refractory mutationsystem PCR)，灵敏度高达0.1％，样品来源包括组织和血液，并且成本与Sanger PCR一样较低，整个检测实验周期不超过一天。

目前，现有的EGFR-TKI敏感突变ARMS PCR检测试剂盒通常包括18外显子、19外显子、20外显子和21外显子上20个以上突变位点的检测。但是，从临床大数据分析来看，其中90％以上的突变集中在19外显子缺失突变和21外显子L858R突变。并且对于没有经过EGFR-TKI治疗的患者来说T790M和20外显子插入耐药突变的发生率非常低。虽然，目前针对EGFR-TKI灵敏突变的检测可以包括多种基因部位的突变检测，但是其中大部分都是低概率发生的突变，无形之中增加了检测成本，由此可能会加重病人的治疗负担。

发明内容