[发明专利]一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用

说明书

本发明公开了一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用。应用该重组蛋白所建立的一种BCoV间接ELISA方法，本发明的牛冠状病毒VPN具有良好的抗原表位，能够在原核细胞中高效表达，构建原核表达载体，用所表达的重组蛋白包被抗原，成功的建立了BCoV间接ELISA诊断方法，并确定该方法的最佳条件，为免疫牛群抗体检测和进行流行病学调查提供了一种快速简便的血清学鉴别诊断方法，它解决了目前对犊牛冠状病毒腹泻的诊断方法存在着费时、费力又不能快速诊断的弊端，以及生物试剂和仪器设备昂贵的经费。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用。

背景技术

牛冠状病毒(Bovne Corona virus，BCoV)属于套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属2a亚群的成员之一，是引起牛腹泻和呼吸道疾病的主要病原之一，临床上主要表现为新生犊牛腹泻，血样粪便，成年牛冬季严重水样腹泻(有时伴有血和黏液)以及各个年龄段牛的呼吸道感染等特征，在Mebsu等(Mebus C A,Stair E L,Rhodes M B,et al.Pathologyof neonatal calf diarrhea induced by a coronavirus-like agent[J].VeterinaryPathology,1973,10(1):45-64.)首次报道了美国的BCoV后，相继报道在日本、爱尔兰加拿大、阿根廷成年牛和犊牛的腹泻样本中普遍存在。俄克拉何马州收集的肉牛呼吸道样本中也检测到BCoV(Fulton R W,Ridpath J F,Burge L J.Bovine coronaviruses from therespiratory tract:antigenic and genetic diversity.[J].Vaccine,2013,31(6):886-92.)。我国由BCoV感染引发的牛冠状病毒病报道较晚，姚火春等(姚火春,杜念兴.牛冠状病毒的血清流行病学调查[J].南京农业大学学报,1990,13(2):117-121.)1990年报道BCo V阳性率为44.3～80.2％。迄今为止，北京、山东、天津、河南、河北规模化奶牛场腹泻粪便中检测出了这种病毒，感染率在33.33％～65.18％，一年四季均可发生，呈散发或地方流行性，它的发生和蔓延给全球肉牛和奶牛产业造成了巨大的经济损失。

目前检测血清中BCV抗体的方法主要有中和试验、HI试验和间接免疫试验等血清学诊断方法。尽管中和试验是一种快速、准确、灵敏度高而成本低的方法，但是在操作上比较复杂，容易出现错误，所以不宜用于临床快速诊断。HI试验存在主观性强，对判定结果的解释难以标化，不适合大批量检测等缺点；间接免疫荧光试验，对操作者技术要求高和需要昂贵设备，不利于推广；而且传统方法多以全病毒为抗原，存在很大的散毒危险。因此，临床上亟需一种简便、快速、特异、能同时大批量检测样品的血清学诊断方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用，该重组蛋白特异性高，易纯化制备、成本低，可作为诊断抗原能够简便、快速、准确的检测出待测血液样品中的冠状病毒。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种牛冠状病毒VPN基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种牛冠状病毒重组VPN蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明还公开了一种含有上述的SEQ ID NO:1所示核酸序列的原核表达载体。

进一步地，所述的原核表达载体为PET-28H-VPN。

本发明还公开了一种制备重组VPN蛋白的方法，其特征在于，包括：用原核表达载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；培养转化体，诱导重组VPN蛋白表达，回收并纯化所表达的重组VPN蛋白。