[发明专利]一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用

权利要求书

1.一种牛冠状病毒VPN基因，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种牛冠状病毒重组VPN蛋白，其特征在于，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述的SEQ ID NO:1所示核酸序列的原核表达载体。

4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为pET-28H-VPN。

5.一种制备权利要求2的重组VPN蛋白的方法，其特征在于，包括：用权利要求3的原核表达载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；培养转化体，诱导重组VPN蛋白表达，回收并纯化所表达的重组VPN蛋白。

6.一种检测或诊断牛冠状病毒的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以牛冠状病毒重组VPN蛋白为包被抗原，该牛冠状病毒重组VPN蛋白由重组质粒pET-28H转化的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达。

7.一种检测或诊断牛冠状病毒的间接ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包被抗原：将权利要求2所述的重组VPN蛋白作为抗原使用50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μL/孔，4℃过夜；抗原的包被浓度为0.2-3.5μg/ml；

(2)洗涤酶标板：次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔；

(3)封闭：加入2％牛血清白蛋白作为封闭液，100μL/孔，37℃1h；

(4)洗涤酶标板：弃去包被液，洗涤3次；

(5)孵育一抗：将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白分别按比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃2h；

(6)洗涤酶标板：弃去板中的液体，洗涤4次；

(7)酶标二抗：加入用1％牛血清白蛋白按一定稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔，37℃1h；HRP标记的羊抗牛IgG的稀释度为1:2500；

(8)洗涤酶标板：弃去板中的液体，洗涤5次；

(9)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色30min；

(10)终止：加入2mol/L H₂SO₄终止反应，100μL/孔；

(11)读数：在酶标仪上读取D_450nm值；试验设标准阳性、标准阴性血清对照。

8.根据权利要求7所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述的标准阳性血清为牛冠状病毒阳性血清；所述的标准阴性血清为胎牛标准阴性血清；所述的酶标抗体结合物为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；所述的底物显色液为四甲基联苯胺。

9.根据权利要求7所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述的抗原的包被浓度为0.2188μg/ml，血清的稀释度为1:200。

10.权利要求1的牛冠状病毒VPN基因或权利要求2的牛冠状病毒VPN重组蛋白在制备检测或诊断牛冠状病毒药物中的应用。